论文部分内容阅读
背景与目的:心肌纤维化是以心脏肌成纤维细胞过度增殖、胶原纤维大量沉积及异常分布为主要特征的心肌重构。它与高血压病、慢性心力衰竭、扩张性心肌病、病毒性心肌炎等多种心血管疾病密切相关,是心源性猝死的潜在危险因素。目前对心肌纤维化的发病机制并不十分明确。CD38是哺乳类动物细胞内以NAD+为底物的合成和降解ADPr的主要酶蛋白,其功能的缺失或增加均可通过调节NAD+及cADPr的含量进而参与许多细胞生物学过程如衰老、心脑血管损伤、胰岛素释放、能量代谢以及炎症反应等。本实验室的前期工作发现,敲除CD38基因对血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)诱导的小鼠心肌肥大和心肌纤维化具有明显的抑制作用。然而,CD38对心肌纤维化的影响及其机制尚不完全清楚。本课题首先构建CD38基因过表达的NIH3T3成纤维细胞系,并以此建立Ang II或TGFβ诱导的体外心肌纤维化模型,进而研究CD38对心肌成纤维细胞诱导的心肌间质纤维化的作用及机制,以期为临床心梗后心肌重塑的防治提供实验依据。实验方法:1.CD38基因过表达NIH3T3细胞系的制备:1)采用不同浓度的G418(0,100,200,400,600,800,1000 ug/m L)对培养NIH3T3细胞的毒性作用,连续观察14天以确定筛选稳定细胞株的最佳浓度;2)将NIH3T3细胞转染pc DNA3.1-CD38质粒48小时后,加入最佳浓度的G418筛选稳定细胞株。两周后挑选单克隆细胞并检测其CD38的m RNA和蛋白表达水平。2.体外细胞纤维化模型的构建及其分析:1)采用不同浓度的Ang II(0,0.1,1,2μM)或TGFβ(0,0.25,5,10 ng/m L)处理NIH3T3细胞,实时荧光定量PCR检测纤维化标记分子I和III型胶原蛋白的m RNA转录水平,Western blot检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的蛋白水平表达,以确定最佳的药物浓度。2)加入终浓度为1mmol/L的Ang II或10ng/m L的TGFβ处理细胞48h后,检测CD38过表达细胞COL1与COL3的m RNA表达量和α-SMA的蛋白表达量。3)CCK8法检测TGFβ诱导后0到48小时之间的CD38过表达细胞和正常细胞的增殖情况。4)划痕实验比较TGFβ处理CD38过表达细胞和正常细胞的迁移能力改变。3.CD38对TGF-β诱导心肌细胞纤维化作用的影响及其分子机制分析:1)Western Blot检测TGFβ对NIH3T3细胞及原代大鼠心肌成纤维细胞CD38过表达对SMAD蛋白磷酸化水平的影响。2)钙离子荧光探针Fluro-3am检测外源性cADPr及CD38过表达对NIH3T3细胞胞内钙浓度的影响。3)Western Blot检测外源性cADPr与CD38过表达对TGFβ诱导α-SMA蛋白表达的影响。4)q-PCR检测原代野生型及CD38基因敲除MEF细胞的纤维化相关基因(FZ、ICAM1、PINK、SMA、SMEMB、TGFβ)、炎症相关基因TLR4以及氧化应激相关基因NOX1与NOX2的m RNA转录水平。实验结果:1.结果表明,400ug/m L的G418为最佳筛选浓度,转染CD38基因后NIH3T3细胞,经两周的药物筛选后,可得到稳定表达CD38基因的细胞株。2.CD38基因过表达可促进TGF-β诱导的NIH3T3细胞纤维化:1)Ang II(1m M)与TGFβ(10 ng/ml)均可显著促进COL1和COL3基因的m RNA及α-SMA蛋白的表达,并呈剂量依赖性。2)CD38过表达可显著增加Ang II或TGFβ诱导NIH3T3细胞COL1与COL3的m RNA和α-SMA蛋白的表达。3)CD38基因过表达可促进TGFβ诱导NIH3T3细胞的增殖,但对细胞迁移无影响。3.CD38基因过表达明显促进TGFβ诱导的SMAD3磷酸化和导致胞内钙失稳态:1)CD38基因过表达显著促进TGFβ诱导的NIH3T3细胞及原代心肌成纤维细胞的SMAD3磷酸化。2)外源性cADPr和CD38基因过表达均可促进TGFβ诱导的胞内钙超载以及α-SMA蛋白表达。3)敲除CD38基因可显著抑制炎症相关基因TLR4、纤维化相关基因TGFβ、COL1、COL3、FZ、SMEMB以及氧化应激相关基因NOX1和NOX2的m RNA表达。结论:1.CD38促进TGFβ诱导的心肌成纤维细胞的活化与增殖。2.CD38通过促进TGFβ诱导的SMAD3磷酸化和胞内钙失稳态进而导致心肌纤维化损伤。