论文部分内容阅读
研究目的本研究基于高通量测序技术对5名健康志愿者接种季节性流感疫苗前后外周血中记忆B细胞重链BCR CDR3序列进行组库特征分析,从免疫组库的角度探讨流感疫苗的免疫效应,为疫苗的免疫效应研究和新疫苗的研发提供新的理论依据和研究思路。研究方法1.本研究共招募志愿者5名,均通过肌肉注射季节性流感疫苗,分别于注射疫苗前和注射疫苗后第28天采集外周血50ml,分离血清,采用间接ELISA法检测志愿者外周血中流感病毒特异性抗体的变化情况;2.于注射疫苗前和注射疫苗后第28天采集外周血50ml,磁珠分选出总B细胞,体外经灭活H7N9病毒刺激6天,Elispot法检测接种疫苗前后志愿者外周血中H3记忆B细胞频率的变化;3.免疫磁珠分离疫苗注射前和疫苗注射后28天外周血记忆B细胞,提取RNA,送华大基因公司进行BCR H-CDR3测序,利用IMGT/High V-QUEST分析软件,将测序得到的序列进行比对分析,分析内容如下:(1)CDR3序列的多样性以及克隆分布与丰度;(2)IGHV、IGHJ、IGHD基因家族取用和配对分布,以观察基因片段取用的偏好性;(3)各样本间CDR3重叠率;(4)CDR3与流感病毒血凝素抗原位点的关系。结果1.接种季节性流感疫苗后,5名志愿者外周血中抗H1、H3流感病毒特异性抗体水平较接种前升高2.682倍和2.096倍。2.接种季节性流感疫苗后,志愿者外周血中流感病毒血凝素H3记忆B细胞频率较接种前提高7.36倍。3.季节性流感疫苗对外周血记忆B细胞BCR CDR3多样性影响3.1克隆CDR3长度分布接种疫苗后,3名志愿者H-CDR3氨基酸长度呈以16AA为主的标准钟型分布,另外两名志愿者分别呈以14AA和17AA为主的偏态分布。3.2 BCR H链V区基因使用频率分布接种疫苗后外周血记忆B细胞BCR H-CDR3组库均高频取用V基因IGHV1-18、IGHV1-3、IGHV1-46、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV5-51,取用频率≥5%。对V基因家族各高频基因(≥2%)接种前后的取用频率做统计学分析发现,基因IGHV1-8(P=0.043)较接种前取用频率降低有统计学意义。3.3 BCR H链D区基因使用频率分布接种疫苗后外周血记忆B细胞BCR H-CDR3组库均高频取用D基因IGHD1-26、IGHD2-15、IGHD3-10、IGHD2-21、IGHD6-19、IGHD3-16、IGHD6-13、IGHD3-22,取用频率≥3%。对D基因家族各高频基因(≥2%)接种前后取用频率做统计学分析发现,IGHD1-1(P=0.043)较接种前取用频率增高有统计学意义。3.4 BCR H链J区基因使用频率分布接种疫苗后外周血记忆B细胞BCR H-CDR3组库IGHJ基因取用分析发现,所有样本均高频取用IGHJ-4基因,取用频率≥50%,IGHJ基因的取用频率进行统计学分析,结果显示与接种前相比各亚基因取用频率均无显著差异。3.5 BCR H链V区和J区基因的组合情况通过对接种疫苗前后外周血记忆B细胞进行BCR H-CDR3组库配对取用分析发现,优势配对取用(≥2%)包括IGHV1-18-IGHJ4、IGHV1-46-IGHJ4、IGHV1-3-IGHJ4、IGHV5-51-IGHJ4、IGHV1-69-IGHJ4、IGHV6-1-IGHJ4、IGHV4-4-IGHJ4、IGHV3-23-IGHJ4。IGHJ区均高频表达IGHJ4家族,IGHV区均高频表达IGHV1、IGHV3家族。基因IGHV1-18-IGHJ4、IGHV1-8-IGHJ4较接种前取用频率的降低具有统计学意义,基因IGHV3-11-IGHJ4(P=0.043)较接种前取用频率的增高具有统计学意义。3.6共有克隆志愿者中4名接种疫苗前后共有克隆比例大于3%,另外一名志愿者接种疫苗前后共有克隆相对较低(1.62%)。5名志愿者在接种流感疫苗前,记忆B细胞BCR H-CDR3共同的氨基酸数目为593条,接种疫苗后,共享氨基酸数目为37条。3.8记忆B细胞BCR H-CDR3组库Top10高频克隆扩增氨基酸序列分析通过对接种疫苗前后外周血记忆B细胞BCR CDR3组库前10条高频克隆扩增的氨基酸序列进行分析发现,接种疫苗前志愿者之间无共享氨基酸序列。接种疫苗后其中三名志愿者共享YFDYW氨基酸序列。结论1.季节性流感疫苗能有效提高外周血流感特异性记忆B细胞频率;2.接种季节性流感疫苗后志愿者外周血记忆B细胞BCR H-CDR3组库IGHV、IGHD、V-J配对基因家族的取用频率发生变化,其中IGHV1-8、IGHV1-18-IGHJ4和IGHV1-8-IGHJ4基因取用频率降低,IGHD1-1和IGHV3-11-IGHJ4基因取用频率增加变化显著,可能与流感疫苗抗原表位相关。3.接种季节性流感疫苗后记忆B细胞BCR H-CDR3组库共有克隆数目下降,提示BCR克隆扩增发生了偏移,优势扩增的克隆可能流感疫苗的抗原表位相关。4.疫苗接种后,不同志愿者之间出现YFDYW共享氨基酸序列,共享序列的出现提示存在相同抗原的表位特异性B细胞克隆。