ProsaptideTX14是一种新型的神经营养肽,由鞘脂激活蛋白原具有神经营养活性的序列改造而成,鞘脂激活蛋白原或ProsaptideTX14可以与神经细胞膜上的PT敏感的G受体结合,活化细胞外调节激酶(ERK),刺激神经细胞中乙酰胆碱酯酶的活性,促进神经细胞的生长和分化。 由于鞘脂激活蛋白原为新发现的神经营养因子,除了其神经营养活性之外,在外围组织的广泛分布,提示ProsaptideTX14可能还有其它生物活性。因此,进一步深入探讨ProsaptideTX14的生物活性及其可能的分子机制,将为研究开发其潜在的临床应用价值奠定基础。基因工程技术是制备短肽的一种行之有效的方法,我们将利用Prosaptide的氨基酸序列合成目的基因,以串联连接方式得到多拷贝的目的片段,采用原核表达的方法高效的制备神经营养肽NP14,进而研究其生物活性。实验的主要内容为: [目的] 采用基因工程的方法制备神经营养肽NP14。 [方法] 1.NP14基因来源于ProsaptideTX14的14个氨基酸,它的第一个氨基酸由苏氨酸改为丝氨酸,然后,通过PCR串联成双拷贝基因2NP,在小肽NP14两端各引进一个蛋氨酸,从而建立了蛋白裂解位点。 2.通过碱性磷酸酶的脱磷酸反应处理的载体pUC18与双拷贝基因2NP片段做平端连接,构建了克隆载体pUC18—2NP。 3.通过蓝白斑筛选得到的重组阳性克隆pUC18—2NP在大肠杆菌JM109中增殖后,经质粒的提取,EcoT14I的酶切,鉴定出阳性重