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海藻糖因其独特的生物学功能近年来被广泛地应用于细胞、组织器官、食品、化妆品和药物制剂、保藏等领域。由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohy-drolase,MTHase)组成的双酶体系可以将淀粉转化成海藻糖,可望成为工业生产海藻糖的新途径。本文主要构建了来源于玫瑰微球菌的MTHase蛋白的pPICZAα重组表达载体,在巴斯德毕赤酵母表达体系中进行了分泌表达研究。首先根据TreZ基因序列设计引物,以玫瑰微球菌基因组为模板,扩增得到1.9Kb目的基因片段。与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性转化子进行菌落PCR及测序验证,序列测定结果与报道完全一致。目的片段经EcoRI和XbaⅠ双酶切处理后定向插入pPICZαA质粒中,成功构建了MTHase的分泌表达载体pPICZαA-MTH。重组质粒经线性化分别电转化导入Pichia pastoris GS115及KM71菌株中,通过Zeocin浓度梯度筛选高拷贝重组菌株,最终在1000μg/ml的浓度下得到若干个单菌落。对得到的GS115菌株进行表型验证,证明均为Mut~+。通过测定重组GS115(pPICZαA-MTH)及KM71(pPICZαA-MTH)菌株在BMGY培养基中生长曲线,以及BMMY诱导培养基中总蛋白含量随时间的变化曲线,确定的最佳转接时间分别为20h和25h,甲醇诱导时间为72h。SDS-PAGE结果显示,经0.5%甲醇28℃下诱导72h后,KM71(pPICZαA-MTH)菌株发酵液样品约72.5KD处出现明显条带,而GS115(PICZAα-MTH)菌株没有预期条带。KM71(pPICZαA-MTH)菌株样品western blot出现单一条带,GS115(pPICZαA-MTH)未出现条带,进一步证明MTHase蛋白在KM71菌株中成功表达,而在GS115菌株中未表达。对GS115(pPICZαA-MTH)菌株不表达原因进行分析。通过RT-PCR证明目的基因在GS115中成功转录,应该是翻译水上的原因导致基因沉默。