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研究目的1．观察c-FLIP(L)蛋白及TRAIL凋亡通路受体DR4／DR5在乳腺癌临床标本及体外培养细胞系中的表达，结合临床病理资料加以分析，初步探讨c-FLIP(L)蛋白、DR4／DR5受体在乳腺癌中的存在意义。2．在乳腺癌组织和细胞系中，观察c-FLIP(L)蛋白与细胞凋亡敏感性的相关性，明确c-FLIP(L)蛋白对乳腺癌TRAIL凋亡通路的调节作用。3．以凋亡信号转导中caspases蛋白酶级联活化程序为切入点，通过研究c-FLIP(L)蛋白和caspase-8分子的相互作用，初步探讨c-FLIP(L)促进乳腺癌细胞TRAIL凋亡通路转导的作用机理。研究方法1．选取乳腺浸润性导管癌和配对的癌旁乳腺组织各150例，应用免疫组织化学方法检测c-FLIP(L)蛋白的表达，搜集患者的临床病理参数，以DR4、DR5的染色评价TRAIL通路受体表达水平，所得结果进行统计学分析。2．体外培养乳腺癌细胞系，应用半定量RT-PCR和Western blot技术从mRNA和蛋白两个水平检测c-FLIP(L)表达水平，通过间接免疫荧光流式技术检测DR4、DR5受体的阳性率，比较不同细胞间上述指标的差异。3．通过TUNEL技术和对Ki-67的免疫组化检测，评价乳腺癌细胞的凋亡指数和增殖指数，分析c-FLIP(L)蛋白表达水平与二者的相关性。4．在乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中，转染特异性表达质粒，应用RT-PCR和Western blot技术检测c-FLIP(L)mRNA和蛋白的表达水平。在c-FLIP(L)高表达的前提下，外源给予TRAIL诱导细胞凋亡，MTT法绘制TRAIL作用的剂量曲线和时间曲线，选择最佳的诱导条件。在TRAIL处理下，应用Annexin V流式细胞分析术、DNA Ladder和相差显微镜技术观察MDA-MB-231细胞在高表达c-FLIP(L)后凋亡敏感性的变化。5．以转染c-FLIP(L)表达质粒的乳腺癌细胞系MDA-MB-231为研究对象，通过caspases蛋白酶活性分析，观察c-FLIP(L)蛋白对酶活性的影响。应用Westem blot技术，检测c-FLIP(L)蛋白与caspase-8分子的酶切水解产物，推测它们的活化过程，并进一步应用免疫共沉淀技术分析二者的相互作用。研究结果1．c-FLIP(L)蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中呈低～中等程度表达(阳性率为36．36％)，在癌旁乳腺组织中呈高表达(阳性率为75％)；其中强阳性染色病例在乳腺癌组织中占14．29％，在癌旁乳腺组织中占57．58％；两组比较有显著性差别(P＜0．01)。统计分析结果显示，c-FLIP(L)蛋白高表达与患者年龄(＜35岁)、绝经前、未发生远处转移、较早的pTNM分期(Ⅰ-Ⅱ期)密切相关以及ER、PR蛋白的表达水平相关(P＜0．05)。2．在体外培养的不同乳腺癌细胞系中，均可检测到c-FLIP(L)mRNA和蛋白的表达，但c-FLIP(L)在不同的细胞间存在表达差异。TRAIL通路受体DR4、DR5在不同的乳腺癌细胞中表达水平不同，相对于每一株细胞来说，二者的阳性率呈现一致性。3．免疫组化染色发现，c-FLIP(L)蛋白的表达与DR4受体的表达呈正相关，二者之间关系有统计学意义(r_s=0．452，P=0．035)；对于DR5受体，虽然呈现出c-FLIP(L)蛋白表达越高，DR5受体表达越高的趋势，但二者之间无明显相关性(r_s=0．419，P=0．066)。此外，c-FLIP(L)蛋白的表达与凋亡指数正相关(r_s=0．554，P=0．005)；该蛋白表达升高增殖指数有所下降，但二者之间无显著相关性。4．转染特异性表达质粒发现，转染后24h，c-FLIP(L)mRNA和蛋白含量出现升高；转染后48h和72h mRNA含量仍能维持较高水平，蛋白的表达量有所下降。在此基础上，TRAIL诱导细胞4h，抑制率出现变化，随时间延长呈现逐渐升高的趋势，其中处理24h可达到较高水平；每个观察时间点下TRAIL浓度为10ng/ml时的抑制率均较高，随浓度加大仍能维持。5．TRAIL诱导后，在高表达c-FLIP(L)的MDA-MB-231细胞中，凋亡细胞比例可升至51．65％；经电泳分析，其DNA断裂呈规律的阶梯状；此时大部分细胞失去原有形态，胞体圆缩，间隙增大，折光性减弱，分裂像少见。6．应用TRAIL诱导凋亡后，在高表达c-FLIP(L)的MDA-MB-231细胞中，caspase-8活性提升5倍，caspase-3活性提升3倍，caspase-9、caspase-2活性变化不明显。7．与转染空载体细胞相比，TRAIL可诱导c-FLIP(L)高表达细胞内的caspase-8蛋白发生酶切降解，全长的p55 caspase-8含量减少，胞浆中出现p43、p18和p10亚片段；同时c-FLIP(L)p55片段含量亦出现降低，p43和p12片段含量增多。通过免疫共沉淀实验发现，c-FLIP(L)蛋白与caspase-8蛋白能够发生相互作用，此外作用复合物上尚可检测到二者的p43片段。研究结论1．通过检测c-FLIP(L)在癌和癌旁组织中的表达、明确该蛋白调节细胞凋亡的作用机制，从体内和体外不同角度证实，c-FLIP(L)在乳腺癌中具有促进TRAIL凋亡通路的作用，其阳性表达提示较为良好的临床预后。2．c-FLIP(L)作为天然存在的蛋白酶类似物，在不同条件下可能存在不同的表达水平、具有截然不同的凋亡调节功能，具体机制仍需要进一步的研究。3．鉴于c-FLIP(L)在不同类型的肿瘤组织和不同个体间存在表达差异，在将其开发为有意义的预测因子和治疗靶点之前，要充分考虑这一特点，注意诊治的个体化。