糖尿病依然是困扰人类健康的重要疾病之一,目前,胰岛细胞移植治疗是较为理想的治疗方法,然而供体的匮乏限制了这一治疗手段的广泛开展。干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞,可以为细胞移植治疗提供优良的种子细胞,给胰岛功能受损的糖尿病患者带来了新的希望。然而胚胎干细胞及成体干细胞,如骨髓间充质干细胞,因受伦理限制或来源与数量的限制,使人们对寻找新的干细胞来源给与了更多的关注。最近几年的研究显示,羊水来源的干细胞(human amniotic fluid-derived stem cells, hAFSCs)作为一种新的种子细胞来源,显示了较好的优势：它们易于分离、培养、扩增,具有较低的免疫原性,体内移植实验未见成瘤报道,具有多向分化潜能,可分化为骨细胞、神经细胞、肝细胞等。目前关于hAFSCs诱导分化为胰岛细胞或胰岛素分泌细胞的研究依然处于初期阶段,相关论文仅一篇。通过文献调研,我们还发现神经元限制性沉默因子(neuronal restrictive silencing factor, NRSF)在干细胞向神经和胰岛分化过程中可能发挥了重要作用。胰岛细胞中的配对盒基因4(paired box gene 4, Pax4)、胰岛-脑1(Islet-Brain 1, IB1)/JNK相互作用蛋白1(JNK-interacting protein 1, JIP-1)以及连接蛋白36(Connexin36)等基因的表达受到NRSF的调控。Pax4是决定胚胎时期内分泌祖细胞定向分化为p细胞的重要的转录因子。IB1/JIP-1和Connexin36分别是调控胰岛p细胞的存活及分泌胰岛素功能的重要成分。胰岛细胞中存在着这些NRSF调控的靶基因提示着NRSF在胰岛细胞的发育过程中可能扮演着重要的角色。此外,在胰岛素瘤细胞系中过表达NRSF会破坏其葡萄糖-胰岛素分泌偶联机制,而在胰岛p细胞中表达NRSF则导致葡萄糖耐受和p细胞数目减少。因此,采用RNA干扰技术干涉hAFSCs中NRSF的表达,以使hAFSCs能够分化为分泌胰岛素的细胞,并为糖尿病的细胞移植治疗提供新的细胞来源,也就成了本实验研究的目的。研究分为两部分：第一部分：人羊水来源干细胞的分离培养与生物学性状分析：方法：取孕中期产前诊断所抽取的羊水组织,离心收集细胞,然后培养扩增。通过形态学观察、姬姆萨显带核型分析、细胞增殖能力测定、流式细胞术、细胞免疫荧光染色及RT-PCR实验等对其基本生物学性状,尤多能性标志进行了较为系统的分析。我们鉴定hAFSCs的多能性,主要以胚胎干细胞已确证的干性标记为标准,检测了阶段特异性胚胎抗原4(stage specific embryonic antigen-4 SSEA-4)、Nanog与Oct4等的表达情况。SSEA-4是一种膜表面糖脂,主要表达在从受精卵到囊胚期内细胞团细胞及原始生殖细胞表面,随发育进行而逐渐减少,成体时主要表达在少数的骨髓间充质干细胞上,是细胞全能性的重要标志之一。Nanog是一种转录因子,开始表达于桑葚胚细胞到囊胚期内细胞团细胞及原始生殖细胞内,后主要表达在外胚层细胞并随发育的进行而逐渐消失,其主要功能是参与胚胎干细胞全能性及胚胎外胚层亚全能性的维持,是细胞全能性的重要标志之一。Oct4也是一种胚胎早期细胞内的转录因子,是人多能干细胞的标志之一,主要表达于人胚胎干细胞,原始生殖细胞内。结果：原代羊水细胞可在5至14天形成细胞群落,细胞呈现两种形态,一部分为成纤维细胞样,一部分为上皮细胞样,后者在传代过程中逐渐消失,到第3代以后,细胞在形态上即可表现为较为均一的成纤维细胞形态。在上述培养条件下hAFSCs具有良好的增殖能力,群体倍增时间约为36h;经长期传代培养,核型保持稳定；流式细胞术检测结果表明,阶段特异性胚胎抗原4(SSES-4)表达率可达80%以上,间充质来源标志CD29、CD90与CD105表达率可达90%以上,主要组织相容性复合物Ⅰ类抗原(MHC classⅠ, HLA-ABC)较强表达,而MHC classⅡ(HLA-DR)未检测到表达；同时,免疫荧光等技术也证实hAFSCs表达部分胚胎发育早期的标志如SSES-4、Nanog、Oct4及Rexl。第二部分：神经元限制性沉默因子在人羊水来源干细胞向胰岛素分泌细胞分化中的作用研究：方法：构建带有绿色荧光蛋白基因的NRSF干涉载体(siNRSF)与打散对照载体(siControl),经慢病毒介导感染hAFSCs。感染第3天利用定量PCR与western blot等技术检测干涉效率。感染后的细胞在诱导培养基下进行诱导培养,诱导分为两个阶段。在第7天与第14天,细胞经RT-PCR与免疫荧光染色鉴定胰岛发育相关基因的表达；在第14天用5.5mM与23mM葡萄糖刺激诱导后的细胞,用超敏ELISA试剂盒检测C-肽释放量及细胞内的C-肽含量,用BCA法测定细胞总蛋白含量,并计算C-肽所占比例。结果：经荧光显微镜观察,慢病毒介导的感染效率可达90%以上,干涉载体导入羊水来源干细胞之后的第三天,细胞内源性NRSF表达降低了70%左右,干涉效率明显,同时RT-PCR结果显示胰岛细胞发育相关基因Pax4表达上调,胰岛素基因启动子活性增强,胰岛素基因也开始微弱表达。在诱导后的第7天至第14天,胰岛细胞发育相关基因,如Pdx1, Isl-1, Nkx6.1都相应表达,胰岛素基因(Insulin)明显表达。在诱导后的细胞中亦发现葡萄糖转运蛋白2(Glut2)的表达,说明诱导后的细胞可能具有葡萄糖感应能力。在对照组中,虽然经过诱导培养基的培养,但未检测到Pdxl, Isl-1, Nkx6.1, Insulin, and Glut2的表达。经免疫荧光染色显示诱导后的细胞,Pdx1、胰岛素与C-肽都能检测到表达,而对照组未发现表达。ELISA结果显示,实验组C-肽胞内含量约为1.24ng/mg,而对照组几乎检测不到。经低浓度与高浓度葡萄糖刺激后,干涉组C-肽释放量显著高于对照组,且表现出了较好的葡萄糖应答反应。结论：hAFSCs是一群呈成纤维细胞样,有良好增殖能力,较低免疫原性,且具有多向分化潜能的细胞。经NRSF沉默与诱导培养基的诱导,hAFSCs能分化为有功能的胰岛素分泌细胞。