研究背景骨质疏松症(OP,osteoporosis)主要是因为骨重塑过程平衡被打破,骨形成与骨吸收过程中后者占主导地位,导致骨量减少、骨微结构破坏、骨折概率增大的一种严重危害患者生命健康的骨代谢疾病。大量研究表明,酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1,CKIP-1)在骨组织增殖、分化过程中起重要作用,其主要与泛素连接酶Smurf1相互作用进而影响骨生长的过程;近年来,大量研究证明力学环境与骨组织生长状况关系十分密切,力学载荷越来越受到大家的关注,尤其是在成骨效应方面。研究目的通过尾吊饲养方法模拟失重环境,进而建立失重性骨质疏松的小鼠模型,研究小鼠胫骨轴向生理性载荷(2500με)与过载(5000με)以及CKIP-1基因敲除对骨质疏松的对抗与治疗作用;希望为临床治疗骨科相关疾病,尤其是太空环境下微重力导致的失重性骨疏松提供一种新的预防或治疗方法,为长期在太空飞行的航天员预防保健提供专业的参考意见和理论基础。研究方法1.骨质疏松模型的建立:将2-3月龄C57BL/6J小鼠随机分为2组,对照组(Normal)、尾吊组(TS),适应性饲养1W后,对照组常规饲养,尾吊组进行鼠尾悬吊饲养,实验周期为4W,试验结束后分别检测两组小鼠胫骨微观参数、力学性能、血生化指标等,观察建模结果。2.不同强度周期性动态力学载荷对微重力下骨质疏松的作用:将2-3月龄C57BL/6J小鼠随机分为4组,对照组(Normal)、尾吊组(TS)、尾吊+生理性载荷组(Loading)、尾吊+过载组(Overloading),适应性饲养1W后,对照组正常饲养,其他各组尾吊饲养4周。尾吊期间,尾掉组小鼠不作其他处理,生理性载荷组小鼠后肢左侧胫骨施加周期性动态力学载荷(使其胫骨中段受到的峰值应变约为2500με),过载组小鼠后肢左侧胫骨施加力学载荷产生的微应变约为5000με。加载时间为20 min,加载频率为15 Hz,1次/3d。试验周期结束后,处死小鼠,断头取血,静止10min后,3000r/min离心30min,取上层血清﹣80℃保存,以备后用。同时,剥离出小鼠后肢离体胫骨,液氮中保存。采用小动物活体计算机断层扫描系统skyscan1076进行microct扫描实验进行骨小梁微观结构检测;干骺端三点弯曲力学实验检测小鼠胫骨骨组织宏观力学性能;血清akp与bgp含量检测成骨活性;实时荧光定量pcr技术检测相关成骨基因表达情况。3.生理性载荷与ckip-1基因敲除对抗微重力下骨质疏松的作用:将2-3月龄c57bl/6j小鼠随机分为2组,尾吊组(ts)、尾吊+生理性载荷组(loading);同时将ckip-1基因敲除小鼠随机分为2组,尾吊组(记为ko)、尾吊+生理性载荷组(记为ko+loading),这样得到共4组小鼠。适应性饲养1w后,对照组正常饲养,其他各组尾吊饲养4周。尾吊期间,尾掉组小鼠不作其他处理,生理性载荷组小鼠后肢左侧胫骨施加周期性动态力学载荷(使其胫骨中段受到的峰值应变约为2500με)。加载时间为20min,加载频率为15hz,1次/3d。试验周期结束后,处死小鼠,断头取血,静止10min后,3000r/min离心30min,取上层血清﹣80℃保存,以备后用。同时,剥离出小鼠后肢离体胫骨,液氮中保存。采用小动物活体计算机断层扫描系统skyscan1076进行microct扫描实验进行骨小梁微观结构检测;干骺端三点弯曲力学实验检测小鼠胫骨骨组织宏观力学性能;血清akp与bgp含量检测成骨活性;实时荧光定量pcr技术检测相关成骨基因表达情况。实验结果(1)骨质疏松模型评价:小鼠尾吊4周后,与正常饲养小鼠相比,尾吊组小鼠骨组织大量流失,骨生物力学性能明显降低,骨微观结构发生破坏、成骨活性显著减弱,说明成功复制了骨质疏松模型。(2)不同强度周期性力学载荷对微重力下骨质疏松的影响:相比尾吊组,生理性载荷组改善了小鼠胫骨的宏观力学性能(p<0.05);过载组也可稍改善尾吊导致的力学性能下降,但作用不明显(p>0.05)。对小鼠后肢胫骨施加2500微应变后,与尾吊组相比,生理性载荷组小鼠胫骨微观结构得到了显著改善(p<0.05),但与对照组相比统计学检验有显著性差异(p<0.05);当胫骨承受5000微应变时,该组骨小梁微观结构与尾掉组相比有改善的趋势,但改变程度没有显著性差异(p>0.05)。施加周期性动态力学载荷可增强成骨活性,并抑制微重力致骨质疏松的发生与发展。其中,生理性载荷作用显著(p<0.05),过载则作用不明显(p>0.05)。生理性载荷可以有效上调bmp-1、col-i、akp的表达,增强成骨作用(p<0.05);过载亦有上述作用,但结果没有显著性差异(p>0.05)。(3)生理性载荷与CKIP-1基因对微重力下骨质疏松的对抗与治疗作用:干骺端三点弯曲实验显示,与尾吊组相比,生理性载荷和CKIP-1基因的缺失均能显著改善由尾吊所致小鼠胫骨组织的力学性能降低的情况,主要表现在其断裂应变、断裂能量的提高(P<0.05),且二者联合作用,改善效应增强。小鼠胫骨微观参数分析发现生理性载荷与CKIP-1基因敲除可以有效抑制尾吊所致骨密度降低、骨组织大量流失等情况(P<0.05)。血清AKP与BGP含量测定结果显示,生理性载荷与CKIP-1基因敲除可以提高与成骨活性相关的AKP与BGP含量,证明上述因素可以提高成骨活性(P<0.05),促进成骨。实时荧光定量PCR结果显示,生理性载荷与CKIP-1基因敲除可以上调成骨相关基因的表达(P<0.05),抑制骨质疏松的发生与发展。实验结论研究通过尾吊饲养小鼠模拟微重力环境导致骨质疏松,尽管与真正意义上的太空微重力环境有一定的差距,并不能完全展示出微重力环境下骨质疏松发生的过程,但是该模型作为一种较为成熟的模拟太空微重力环境的方法,其结果可以为太空长期作业人员提供一种可能的预防或治疗骨质疏松的方法。主要结论如下:(1)小鼠尾吊4周后,可成功复制失重性骨质疏松模型;(2)生理性载荷与CKIP-1基因敲除均可有效抑制骨质疏松的发生与发展,基因的调控效应大于力学载荷调控作用,且二者共同作用效应会加强;(3)过载也可以改善微重力致骨质疏松,但作用效果没有显著性差异。