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第一部分听皮层早衰大鼠模型的建立目的:通过注射D-半乳糖建立大鼠听皮层早衰模型。方法:1月龄Sprague Dawley(SD)大鼠180只,随机分为两组:实验组为拟老化组,连续8周进行D-半乳糖500mg/kg/d颈背部皮下注射的处理;对照组为生理盐水组,同样连续处理8周,每天对大鼠进行颈背皮下注射,给予与D-半乳糖组同等体积的生理盐水(每100g大鼠体重注射的生理盐水体积与D-半乳糖组每100g大鼠体重注射的D-半乳糖体积一样)。注射期间注意每天对注射部位消毒处理。8周注射结束后,将D-半乳糖组和生理盐水组再各分为3个小组,分别是3月龄组(注射结束后0个月)、9月龄组(注射结束后6个月)和15月龄组(注射结束后12个月)。每个亚组30只SD大鼠。造模结束后,对每只大鼠的听力通过听性脑干反应(Auditory Brainstem Response,ABR)进行检测;大鼠听皮层线粒体DNA的常见缺失(CD)水平通过RT-PCR技术来进行检测;大鼠听皮层神经元超微结构的退行性改变通过透射电镜观察研究;听皮层神经元密度的变化采用甲苯胺蓝染色法观察记录;通过TUNEL染色以及蛋白印迹、免疫荧光法检测听皮层细胞凋亡水平。结果:ABR检测结果显示听阈随着年龄的增长而升高,拟老化组与同月龄、相同频率(4kHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz)的对照组比较,阈值差异无统计学意义(P>0.05);D-半乳糖组mtDNACD与同龄对照组相比升高,差异具有统计学意义,在3、9月龄时P<0.05,15月龄时P<0.01;在对照组内,15月龄较3月龄CD水、平明显升高(P<0.01),D-半乳糖组内,15月龄同3月龄相比,CD水平明显升高(P<0.01)。透射电镜观察结果显示,同月龄的拟老化组与对照组大鼠相比,细胞核变形,染色质固缩,线粒体肿胀变形、数量减少,脂褐素沉积,神经纤维脱髓鞘样变等细胞衰老的超微结构病理变化出现时间较早,并且退行性变更加显著;甲苯胺蓝神经元染色结果显示,15月龄时,拟老化组大鼠与自然老化组大鼠相比,听皮层神经元密度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);TUNEL染色以及Western blotting、免疫荧光结果表明,拟老化组大鼠听皮层TUNEL阳性数目以及Cleaved CASP3蛋白表达水平与同月龄的自然老化组大鼠听皮层相比,在3月龄时无明显差异,但是在9、15月龄时,细胞凋亡水平明显增加。结论:D-半乳糖长期慢性处理导致大鼠听皮层线粒体DNA常见缺失累积;听皮层神经元密度下降、神经元细胞超微结构退行性变过早出现;听皮层细胞凋亡水平升高。D-半乳糖加速了听皮层细胞衰老的进程,促进了老年性聋的发生。第二部分观察大鼠听皮层中自噬水平随着年龄的变化及自噬在听皮层衰老中的作用并探讨AMPK-mTOR-ULK1信号通路对自噬的调控机制目的:老年性聋已成为严重影响老年人生活质量的重要疾病因素之一,但是到目前为止老年性聋的发病机制尚不清楚。自噬已被证实在多种疾病中的发生发展过程中起到重要作用,近年来自噬在神经退行性疾病中的研究越老越多,但在中枢性老年性聋方面却未见相关研究。本研究的目的是观察自噬在大鼠听皮层的退化过程中的变化及其作用,以及对自噬相关调控机制的研究。方法:1月龄SD大鼠180只随机分为两组:其中实验组大鼠连续8周给予颈背皮下注射D-半乳糖500mg/kg/d;对照组为生理盐水组,同样连续处理8周,每天对大鼠进行颈背皮下注射,注射剂量根据体重计算,体积同D-半乳糖。注射期间注意每天对注射部位消毒处理。8周注射结束后,将D-半乳糖组和生理盐水组再各分为3个小组,分别是3月龄组(注射结束后0个月)、9月龄组(注射结束后6个月)和15月龄组(注射结束后12个月)。实时定量PCR检测自噬相关基因LC3、BECN1和凋亡相关基因BAX,BCL-XL,BCL2的mRNA表达水平;Western blotting 检测 LC3、BECN1、p62、BAX、BCL-XL、BCL2 和AMPK-mTOR-ULK1 信号通路相关蛋白 P-AMPK、P-mTOR、P-ULK1、Atg13、P-4EBP1、Atg5、Atg7的蛋白表达;免疫荧光技术检测LC3、BECN1、p62和BCL2在听皮层的定位及表达水平的变化。结果:对自噬相关基因及凋亡相关基因mRNA通过RT-PCR检测表明,与自然老化组相比,拟老化组LC3 mRNA水平在3月龄、9月龄分别上升了 1.52倍(P<0.05)和 1.64 倍(P<0.05);BECN1 mRNA 水平在 3 月龄 上升了 1.84 倍(P<0.05);在15月龄,和自然老化组相比,拟老化组LC3、BECN1mRNA水平分别下降了 1.35倍(P<0.05)和1.21倍(P<0.05);促凋亡基因BAX在9、15月龄mRNA分别上升了 1.45倍(P<0.05)和1.70倍(P<0.01);抗凋亡基因BCL-XL在3月龄升高了 1.47倍(P<0.05),在15月龄降低了 0.76倍(P<0a05);BCL2在3月龄、9月龄分别升高了 1.94倍(P<0.01)和1.6倍(P<0.05),在15月龄降低了 2.1倍(P<0.01)。Western blotting结果显示,较同龄对照组相比,拟老化组听皮层自噬相关蛋白LC3-Ⅱ在3月龄、9月龄分别升高了 2.56倍(P<0.05),1.93 倍(P<0.05);在 15 月龄下降了 1.96 倍(P<0.01)。BECN1 在 3 月龄升高了 1.74倍(P<0.01);在15月龄下降了 1.24倍(P<0.05)。较同龄对照组相比,自噬降解底物p62在拟老化组3、9月龄明显降低,分别下降了 2.41,1.75倍,在15月龄升高了 1.20倍。此外,和同龄自然老化组相比,拟老化组促凋亡蛋白BAX在9、15月龄分别上升了 1.8倍(P<0.05)和5.86倍(P<0.001)。抗凋亡蛋白BCL2在拟老化组大鼠听皮层表达水平在3月龄和9月龄均明显升高,分别升高了 2.4倍(P<0.001)和2.36倍(P<0.01);在15月龄时,拟老化组BCL2明显下降,下降了 3.67倍(P<0.001)。抗凋亡蛋白BCL-XL在3月龄时拟老化组较对照组升高了 1.5倍(P<0.05),15月龄时,下降了 1.9倍(P<0.05)。此外,较对照组相比,BCL-XL/BAX在拟老化组3月龄上升了 1.83倍(P<0.05),在9月龄、15 月龄分别下降了 1.67 倍(P<0.05),8.3 倍(P<0.001);BCL2/BAX 在 3 月龄明显上升了 3.4倍(P<0.01),在15月龄明显降低了 10.6倍(P<0.001)。Western blotting对AMPK-mTOR-ULK1信号通路相关蛋白检测表明,与同龄对照组相比,拟老化组P-AMPK在3月龄升高了 1.47倍(P<0.01),在9月龄、15月龄分别降低了 6.64 倍(P<0.001)和 6.05 倍(P<0.001);P-mTOR 和 P-ULK1 在 3 月龄分别降低了 1.33倍(P<0.05)和2.02倍(P<0.001),在9月龄分别升高了 5.05倍(P<0.001)和 1.36 倍(P<0.01),在 15 月龄分别升高了 1.75 倍(P<0.01)和1.26 倍(P<0.05);Atg13 在 3 月龄、9 月龄分别升高了 1.13 倍(P<0.05)和 2.24倍(P<0.01),在15月龄降低了 1.35倍。免疫荧光结果显示,LC3和BECN1蛋白表达量在3月龄拟老化组较同龄对照组明显升高(P<0.001,P<0.01),在15月龄时明显降低(P<0.001,P<0.01);较同龄对照组相比,拟老化组p62在3月龄明显降低(P<0.01),在15月龄明显升高(P<0.01);BCL2在3月龄(P<0.01)、9月龄(P<0.05)拟老化组较同龄对照组均明显升高,15月龄时较对照组明显降低(P<0.001)。此外,Western blotting结果表明,在本实验中,4EBP1活性与自噬活性的改变没有明显相关性。结论:自噬水平在大鼠听皮层随着年龄的增长而改变,从青年到中年,自噬水平呈现升高的趋势,到老年时下降,并且和抗凋亡蛋白BCL2、BCL-XL协同抵抗细胞凋亡。在D-半乳糖诱导的拟老化组,3月龄时,自噬水平代偿性升高,起到了保护作用;9月龄时自噬开始出现失代偿,细胞凋亡水平明显高于对照组并开始出现神经退行性变,15月龄时,D-半乳糖组自噬水平己明显降低,提早进入衰老状态。此外,AMPK-mTOR-ULKl信号通路可能参与了大鼠听皮层自噬水平的调控,AMPK活性的下降以及mTOR活性的增加导致了自噬的受损,进而导致了早衰的发生;4EBP1活性和自噬水平的改变没有明显的相关性。