搔痒(itch, or pruritus)是一系列皮肤疾病的主要症状,轻微的搔痒具有自我保护性生理作用,而慢性搔痒则是一个重要的临床问题。在很长一段时间内搔痒被认为是亚疼痛感受的一种,因此搔痒与疼痛是否通过同样的传导通路上传外界刺激的争议一直以来都存在。通常疼痛刺激可以减轻搔痒的感觉。缓激肽(bradykinin, BK)是公认的致痛剂,皮内注射后可产生烧灼样疼痛,但对于特应性皮炎患者来说,缓激肽却可以引起皮损区明显的搔痒感,因而这是病理状态下的一种异常痒感觉。但目前用于研究皮炎的动物模型均会出现自发性搔抓,干扰目的指标的观察。而由完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)引起的慢性炎症模型可以排除这一干扰。我们的前期研究则发现,致痛剂辣椒素可引起CFA炎性皮损区的颈背部搔抓,并且这种搔抓可被纳洛酮抑制,说明这是一种搔痒相关行为。但缓激肽是否也可引起CFA炎性皮损区搔痒相关反应却不得而知。缓激肽是激肽释放酶-激肽系统最重要的活性产物,在机体心血管系统、神经系统、内分泌系统等全身各系统中有重要的生理和病理功能。缓激肽为九肽肽段,主要通过与两种亚型的G蛋白耦联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)受体,即缓激肽B1受体(bradykinin B1receptor, B1R)和缓激肽B2受体(bradykinin B2receptor, B2R)结合发挥生物学作用。缓激肽局部注射使人产生疼痛,而当B1R被选择性拮抗后,或者使用B1R基因敲除动物模型,缓激肽局部注射引起的疼痛反应会减轻,提示B1R可能介导疼痛的传导。B2R则分布广泛,在中枢及外周大多数组织中存在生理性表达。而有关B1R和B2R在搔痒传导机制中的作用的研究却鲜有报道。临床上不仅常见的疼痛刺激可引起特应性皮炎患者皮损区的搔痒,即使轻微的接触,例如棉签轻触在患者的皮损区,也会诱发明显的搔痒。这种轻微的非伤害性机械刺激即可诱发搔痒的现象被称作触诱发痒(alloknesis)。触诱发痒也是一种异常的痒感觉,并且提示了可能存在一种中枢敏感机制,由轻微的触碰等非伤害性刺激即可产生明显的痒感。本研究亦计划在CFA炎性皮损区制作触诱发痒反应模型,并对将对缓激肽受体在触诱发痒反应中的作用做进一步研究。第一章缓激肽受体在致痛剂引起搔痒中的作用目的本研究将通过建立CFA炎症动物模型,并首次在此炎症模型的基础上研究致痛剂缓激肽的致痒作用,再进一步探讨B1R和B2R在这种异常痒感觉中所起的作用,然后对可能的下游通路进行探索。材料与方法1.实验动物本研究选用雄性C57BL/6J小鼠,体重20-25g,购自中山大学实验动物中心。实验动物的使用及处理方法均符合广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求,并尽可能减少使用动物的数量。2.动物模型制备及行为学观察1)CFA颈背部注射引起搔抓反应的观察小鼠颈背部局部皮内注射CFA(50μL,对照组注射生理盐水)后,并在第0、6、24、48、72和96h观察小鼠用后肢搔抓CFA注射部位的次数,小鼠完成从举起后肢搔抓注射部位到放下后肢全过程为一次搔抓,记录每只小鼠30min内的搔抓次数。2)缓激肽引起CFA炎性皮损区搔痒的行为学观察小鼠在接受CFA(50μL)颈背部皮内注射96h之后,于实验前30min放置于透明塑料盒内预适应。然后用胰岛素注射针(30G针头)进行皮内注射不同浓度的缓激肽(0～1mmol/L,50μL),颈背部注射药物后立即放入塑料盒内观察小鼠用后肢搔抓缓激肽注射部位的次数,每只小鼠观察30min。3.B1R与iNOS在CFA炎性皮损区的表达情况小鼠颈背部注射CFA(或者生理盐水)96h后,在七氟醚麻醉后取颈背部炎性皮损区(或者生理盐水对照组)全层皮肤经过4%多聚甲醛固定、20%和30%蔗糖溶液脱水、冰冻切片、抗原修复与封闭、孵育一抗与二抗、封片等步骤后用荧光显微镜在200倍物镜下观察B1R与iNOS的共表达情况。4.统计学方法本研究各组数据均采用均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS13.0版统计软件包进行分析。两组间数据采用独立样本t检验(正态分布并且方差齐时)或者近似法t’检验(方差不齐时)；组间多重比较采用单因素方差分析中的Dunnett检验(正态分布并且方差齐时)或者Dunnett-T3检验(方差不齐时)。重复测量数据的比较采用重复测量方差分析中的Bonferroni检验；析因设计资料采用两因素析因设计方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.CFA颈背部注射引起的搔抓反应小鼠颈背部皮内注射CFA(50μL)可在48h内可产生明显的搔抓行为,但72h后,CFA则基本不引起明显的搔抓行为。因此,为减小CFA炎症对缓激肽引起搔痒的影响,我们均在CFA注射96h(4d)后进行本研究其他的各项实验。2.缓激肽引起CFA炎性皮损区的搔抓反应CFA致炎4d后,我们在五组小鼠的CFA炎性皮损区皮内注射浓度分别为0～1.0mmol/L的缓激肽50μL,结果显示与对照组相比,0.1、0.5和1.0mmol/L的缓激肽均可引起小鼠颈背部明显的搔抓反应(*P<0.05),并且呈现剂量依赖性,并且在浓度为0.5和1mmol/L的搔抓次数趋于平稳,因此本研究接下来的实验中缓激肽的浓度均采用1mmol/L接下来CFA致炎第4d至第35d分别在炎性皮损区皮内注射缓激肽(1mmol/L)。结果显示缓激肽引起的搔抓反应在CFA致炎第4d至第7d趋于平稳,而从第14d起开始,缓激肽引起的搔抓开始逐渐下降,这提示缓激肽引起的搔抓反应与时间效应间有负相关关系。因此在本研究接下来的各步实验中我们均在CFA致炎第4d注射浓度为1mmol/L缓激肽50μL来观察搔抓反应。3.B1R和B2R在缓激肽引起搔痒中的作用腹腔注射10mg/kg的B1R拮抗剂(DALBK)可分别使缓激肽(1mmol/L)和B1R激动剂(0.4mmol/L)引起的小鼠30min内的搔抓次数明显减少(*P<0.05),而DALBK (5nmol)与缓激肽混合后局部注射却对搔抓反应物明显影响。B2R拮抗剂(D-Arg-[Hyp3,D-Phe7]-BK,10mg/kg)腹腔注射或者与缓激肽混合后局部注射均可使小鼠30min内的搔抓次数显著增加(*P<0.05)。免疫荧光染色结果也表明B1R在CFA炎性皮损区有较突出表达。这提示B1R介导炎性皮损区疼痛向搔痒的转化,而B2R的作用则与之相反。辣椒素引起的搔痒依赖于TRPV1,而腹腔注射capsazepine (TRPV1抑制剂,4mg/kg)对缓激肽引起的搔抓反应无明显影响,说明缓激肽引起的搔痒是非TRPV1依赖性的。4. iNOS和NF-κB在缓激肽引起搔痒中的作用腹腔注射L-NIL (iNOS抑制剂,5mg/kg),或者PDTC (NF-κB抑制剂,10mg/kg)均可显著减少缓激肽(1mmol/L)在炎性皮损区引起的搔抓反应(’P<0.05),说明NF-κB/iNOS可能参与介导缓激肽引起CFA炎性皮损区的搔痒反应。第二章缓激肽受体在触诱发痒反应中的作用目的研究拟利用CFA炎性小鼠,在排除其自发性搔抓的情况下,观察非伤害性机械刺激否会引起CFA炎性皮损区的触诱发痒行为,进一步探讨缓激肽B1R和B2R在触诱发痒这一异常痒感觉中所起的作用。材料与方法1.实验动物本研究选用雄性C57BL/6J小鼠,体重20-25g,购自中山大学实验动物中心。实验动物的使用及处理方法均符合广东省医学科学院动物实验伦理委员会的要求,并尽可能减少使用动物的数量。2.动物模型制备及行为学观察小鼠在接受CFA (50μL)颈背部皮内注射96h之后,于实验前30min放置于透明塑料盒内预适应。然后用von Frey细丝(弯曲力度：1.6mN)垂直轻打在小鼠颈背部炎性皮损区边缘,每次打3个不同的点。若每次机械刺激后小鼠完成从举起后肢搔抓注射部位到放下后肢全过程为一次搔抓,记为“1”分；若未引起搔抓行为,记为“0”分。每隔5min重复一次上述操作,并持续观察30min。记录每只小鼠每5mmin内的触诱发痒得分情况及30mmin内总的得分情况。3.统计学方法本研究各组数据均采用均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS13.0版统计软件包进行分析。两组间数据采用独立样本t检验(正态分布并且方差齐时)或者近似法t’检验(方差不齐时)；组间多重比较采用单因素方差分析中的Dunnett检验(正态分布并且方差齐时)或者Dunnett-T3检验(方差不齐时)；30mmin内每5mmin间的数据多重比较采用重复测量方差分析中的Bonferroni检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.CFA炎性皮损区可引起触诱发痒行为CFA炎症后第96h,我们采用弯曲力度为1.6mN的von-Frey细丝轻打在小鼠的炎性皮损区边缘,每只小鼠观察30min,记录每5min内的触诱发痒得分及30min内的总得分数。结果显示CFA炎症皮损区可诱发明显的触诱发痒反应,其30min内总得分为2.6±0.37,而对照组为0。这种触诱发痒反应可被纳曲酮(naltrexone,1mg/kg)抑制(*P<0.05),而对组胺-1受体(H1R)拮抗剂美吡拉敏(mepyramine,40mg/kg)无明显反应。说明非伤害性刺激可诱发CFA炎性皮损区的触诱发痒反应,并且这种触诱发痒反应是一种非组胺依赖性的搔痒相关反应。2.B1R和B2R在触诱发痒反应中的作用腹腔注射R892(B1R拮抗剂,500ug/kg)可显著减少CFA炎性皮损区30min内的触诱发痒得分(*P<0.05),而腹腔注射Hoe140(B2R拮抗剂,300nmol/kg)却可以显著增加CFA炎性皮损区的触诱发痒得分(*P<0.05)。说明B1R可能介导了CFA炎症小鼠的触诱发痒行为,而B2R的作用与之相反。3. iNOS和NF-κB在触诱发痒反应中的作用腹腔注射L-NIL (iNOS抑制剂,5mg/kg),或者PDTC (NF-κB抑制剂,10mg/kg)均可显著减少CFA炎性皮损区30min内的触诱发痒得分(*P<0.05)。说明NF-κB/iNOS可能参与介导CFA炎性皮损区的触诱发痒反应。全文结论1.致痛剂缓激肽可在CFA炎性皮损区诱发搔痒反应,这是一种异常的痒感觉。2.非伤害性机械刺激可在CFA致炎的非搔痒性炎性皮损区引起触诱发痒反应,这是本研究发现的一种新的用于研究触诱发痒的动物模型。3. CFA炎性皮损区的触诱发痒反应和致痛剂缓激肽引起的搔痒反应均由B1R介导；而B2R的作用则与之相反,B2R参与抑制这两种异常痒感觉的产生。4. NF-KB/iNOS可能参与介导CFA炎性皮损区的触诱发痒反应和缓激肽引起的搔痒反应这两种异常痒感觉。