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目的:本试验旨在研究布鲁氏菌感染期间,TBK1于炎症信号通路的调控作用,探究布鲁氏菌基于TBK1的免疫逃逸“手段”,为进一步认识固有免疫应答和揭示布鲁氏菌的胞内寄生机制奠定研究基础。方法:（1）探究布鲁氏菌感染细胞过程对NF-κB信号通路的影响,以流产型布鲁氏菌S2308侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,收集0、4、12、24、48h的m RNA和蛋白质,对促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）、NF-κB信号通路蛋白（IKBα、P65、P-IKBα、P-P65）进行相对定量检测。m RNA Human Gene Expression Microarray V3.0对S2308感染24小时后的人髓系白血病单核细胞THP-1进行转录组测序,R语言可视基因差异表达情况,富集TBK1交互基因,GO、KEGG分析TBK1生物学功能。（2）考证TBK1是否参与布鲁氏菌体外感染巨噬细胞活化NF-κB信号通路诱导促炎性细胞因子的大量表达,设计合成si-TBK1干扰片段并构建PCDNA3.1-TBK过表达载体,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,建立TBK1基因表达调控细胞模型。以S2308侵染经转染si-TBK1、PCDNA3.1-TBK1的小鼠巨噬细胞RAW264.7,收集12h和24h的m RNA和蛋白质,对促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）、NF-κB信号通路蛋白（IKBα、P65、P-IKBα、P-P65）进行定量检测,并探究TBK1的差异表达对于布鲁氏菌胞内存活数量的影响。（3）筛选、鉴定、验证与TBK1存在相互作用的布鲁氏菌蛋白,首先构建布鲁氏菌分泌蛋白酵母双杂交AD文库和PGBKT7-TBK1诱饵质粒,检测诱饵蛋白是否存在自激活现象和酵母细胞毒性作用后,通过酵母共转法筛选与TBK1存在相互作用的布鲁氏菌分泌蛋白。以Haddock 2.4、Ligplot1.4.5、Py Mol2.2.0、Prodigy对TBK1和BMCO进行建模,分析蛋白结合位点,建立蛋白对接模型。构建PDSRED2-C1-TBK1和PDSRED2-C1-BMCO荧光定位载体,观察TBK1和BMCO的细胞定位情况。构建PCDNA3.1-EGFP-TBK1绿色荧光载体,观察TBK1和BMCO的细胞共定位情况。构建PACGFP-TBK1、PCMV-BMCO免疫共沉淀功能载体,共转入293T细胞,进行免疫共沉淀验证TBK1和BMCO的相互作用。（4）探索TBK1与BMCO相互作用的生物学意义,构建BMCO基因回补质粒,重叠延伸PCR融合BMCO上下游同源臂和kan抗性基因,利用卡那霉素抗性替换构建布鲁氏菌BMCO基因缺失株,连续培养15代对能够稳定遗传生物学特性的缺失株电转p BBR1MCS-4-BMCO质粒。以S2308ΔBMCO、S2308和S2308ΔBMCO::BMCO侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,收集12h和24h的m RNA和蛋白质,对促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）、NF-κB信号通路蛋白（IKBα、P65、P-IKBα、P-P65）和TBK1进行定量检测,感染复数（MOI）100:1的比例感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,在不同时间点检测亲本株、缺失株、回补株在细胞内的存活数量。结果:（1）布鲁氏菌感染后,NF-κB信号通路被激活（P＜0.001）,促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的相对表达量显著提高（P＜0.001）,该趋势在12h或24h时最为明显。转录组结果显示,布鲁氏菌感染期间,共有71个差异表达的m RNA（34个上调,37个下调）。TBK1在布鲁氏菌感染期间的表达量显著提高（P＜0.05）,富集分析结果显示,TBK1参与先天固有免疫应答,能介导DNA病毒及RNA病毒感染免疫信号通路的活化,并且作为NF-κB激活因子,调控NF-κB信号通路,对下游炎性细胞因子的表达具有重要调控作用。（2）干扰片段si RNA-TBK1-2干扰效率为70%,表达载体PCDNA3.1-TBK1表达效率为6倍,成功建立TBK1基因表达调控细胞模型。布鲁氏菌感染期间,TBK1的干扰有效降低了促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的表达水平,抑制了NF-κB信号通路活性,提高了布鲁氏菌胞内存活数量（P＜0.001）,过表达TBK1提高NF-κB信号通路活性,促进促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的表达,降低布鲁氏菌在胞内的存活数量（P＜0.001）。（3）成功构建布鲁氏菌分泌蛋白酵母双杂交文库,PGBKT7-TBK1诱饵蛋白不存在自激活现象和细胞毒性,筛选、鉴定、验证了1个与TBK1存在相互作用的布鲁氏菌分泌蛋白—BMCO。Haddock2.4建立BK1与BMCO对接模型,解离常数为1.4x10-10,结合能为-13.4 Kcal/mol。TBK1、BMCO均定位于细胞质,扫描激光共聚、免疫共沉淀结果表明,TBK1与BMCO在细胞中能发生稳定结合,具有较强的相互结合作用。（4）成功构建具有遗传稳定性的布鲁氏菌BMCO基因缺失株、回补株,分别命名为S2308ΔBMCO和S2308ΔBMCO::BMCOS2308。以不同菌株侵染细胞,结果显示,TBK1的表达量不受BMCO影响,BMCO可以抑制宿主NF-κB信号通路,降低促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的表达,促进布鲁氏菌在细胞内的存活数量（P＜0.001）。结论:布鲁氏菌体外感染巨噬细胞期间,布鲁氏菌分泌蛋白BMCO通过靶向TBK1,抑制NF-κB信号通路活性,降低促炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的表达,提高布鲁氏菌在胞内的存活数量,促进布鲁氏菌在胞内的持续性感染。