【摘 要】
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辣椒素受体VR1在伤害性感受器痛觉感受过程中起重要作用,近年来随着对其分子药理学机制研究的不断深入,特别是VR1 cDNA的成功克隆,使以其作为药物作用靶点展开相关研究成为可
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辣椒素受体VR1在伤害性感受器痛觉感受过程中起重要作用,近年来随着对其分子药理学机制研究的不断深入,特别是VR1 cDNA的成功克隆,使以其作为药物作用靶点展开相关研究成为可能.该论文中将研究建立体外VR1高通量筛选模型,并对其灵敏性、特异性等特征进行初步评价.编码VR1的cDNA通过RT-PCR技术从新生大鼠的背根神经节组织制备获得,构建入质粒载体pEGFP-N3.将重组质粒pEGFP-VR1导入原核宿主E.coli JM109中扩增、提纯,经酶切检验和全长测序后用于真核细胞转染实验.用阳离子脂质体法转染法将pEGFP-VR1导入HEK293细胞中进行表达,使用氨基甙类抗生素G418筛选阳性克隆,建立稳定表达VR1的细胞株,并用western-blots和RT-PCR方法加以鉴定.稳定表达VR1的HEK293细胞株传代入96孔细胞培养板中,用fura-2/AM钙离子荧光探针指示加药后胞浆钙离子瞬变情况,用荧光微孔板读数仪在340/380nm双激发波长扫描510nm发射波长,根据双波长钙离子浓度检测方法来筛选作用于VR1的先导化合物用于新型外周镇痛药的开发.以辣椒素类活性物质共同结构香兰素为母核合成一系列新化合物,合并阳性药辣椒素和卡巴胆碱用于所建模型的测试性筛选.研究结果显示HEK293-VR1筛选模型,在一定剂量范围内对辣椒素激动有典型的量效关系曲线,相同剂量时辣椒素激动引起的胞浆钙离子上升程度明显高于卡巴胆碱,表明此模型符合相关的灵敏性和特异性要求.
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