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目的脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后的继发性损伤是造成脊髓功能障碍的重要原因,其中过度炎症和过度反应性胶质化导致的胶质瘢痕形成具有重要地位,白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)是重要的促炎因子,波形蛋白(Vimentin,Vim)是反应性胶质化相关因子。然而,IL-6和Vim在SCI后的相互关系尚不清楚,IL-6是否通过调控Vim影响SCI运动功能尚未见报道。因此,本实验首先观察大鼠SCI后IL-6和Vim的表达变化,然后用慢病毒干扰IL-6 m RNA的表达,观察抑制IL-6后Vim的表达变化及其对星形胶质细胞反应性胶质化和大鼠运动功能的影响。方法第一部分94只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(Sham组)和脊髓损伤组(SCI组)。SCI组包含5个亚组:12 h、3 d、7 d、14 d、28 d组。利用改良Allen’s法制备大鼠脊髓钝挫伤模型,通过Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分评价大鼠后肢运动功能恢复情况,苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)观察脊髓组织形态学变化,免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹(Western Blot,WB)观察IL-6和Vim蛋白在脊髓组织中的定位和定量。实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR)检测IL-6、Vim基因表达。第二部分首先采用生物信息学预测IL-6和Vim是否具有相互联系,再用体外和体内实验进一步探究。选取3日龄SD幼鼠的大脑皮质,体外培养星形胶质细胞(Astrocyte,Ast),分为载体组(Vector组)和慢病毒介导IL-6低表达的病毒组(IL-6-RNAi-LV组),通过qRT-PCR检测IL-6 m RNA的表达量验证病毒感染效果。然后制备细胞划伤模型,采用qRT-PCR、WB、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测Vim基因和蛋白表达及定位,MTT检测划伤模型中Ast增殖率,IF检测GFAP用于观察划伤模型中Ast活性;体内实验将66只SD大鼠随机分为载体组(Vector组)和病毒组(IL-6-RNAi-LV组),通过qRT-PCR验证病毒感染效果,BBB评分评估术后大鼠的运动功能变化,通过IHC、qRT-PCR、WB检测抑制IL-6后Vim的定位及基因和蛋白表达变化。结果一、IL-6和Vim的表达变化1.模型评价:BBB评分显示SCI组评分显著低于Sham组(P<0.01),术后7d评分开始恢复,7 d、14 d和28 d组评分均较1 d组明显增加(P<0.01)。HE染色显示Sham组脊髓组织结构完整,细胞和纤维排列整齐;3 d组出现出血灶,并有细胞坏死和白细胞浸润,细胞核固缩,胞体肿胀,神经纤维排列不规则;28 d组出现组织空洞。2.蛋白定位和表达:IHC结果显示SCI后IL-6和Vim在神经元和胶质细胞均有表达;WB显示IL-6蛋白含量在12 h组较Sham组增高(P<0.05),Vim蛋白含量在14 d和28 d组均高于sham组(P<0.05)。3.基因表达:qRT-PCR结果显示12 h组的IL-6 mRNA较Sham组显著增加(P<0.05),并且明显高于术后3 d、7 d、14 d和28 d组(P<0.05)。Vim mRNA在7 d、14 d和28 d组较Sham组增高(P<0.05)。二、IL-6对Vim的调控机制1.生物信息学分析:GeneMANIA分析表明IL-6和Vim之间具有间接共定位和间接共表达的关系。2.慢病毒感染验证:在体内外用qRT-PCR检测IL-6 mRNA表达量,结果显示病毒组中IL-6 mRNA表达量明显低于载体组(P<0.05),证明成功抑制IL-6。3.体外实验3.1 Ast纯度鉴定:IF检测细胞中的GFAP,纯度达97%,Ast培养成功。3.2划伤模型中Ast增殖率和活性:MTT结果显示病毒组中细胞增殖率低于载体组(P<0.05)。IF结果显示病毒组荧光强度低于载体组。3.3 Vim的表达及定位:划伤细胞2 d后,用qRT-PCR和WB检测结果提示病毒组的Vim m RNA和蛋白表达量较载体组明显下降(P<0.05)。IF结果显示Vim主要在Ast胞质中表达。4.体内实验4.1抑制IL-6后对SCI大鼠运动功能的影响:BBB评分显示7 d、14 d和28d病毒组的评分较载体组有显著升高(P<0.05)。4.2抑制IL-6后Vim的蛋白定位和定量:在SCI后7 d、14 d和28 d,IHC显示Vim在神经元和神经胶质细胞中定位表达,病毒组的Vim阳性细胞数较载体组明显下降(P<0.05)。此外,WB结果显示在病毒28 d组的Vim蛋白表达量较载体组明显下调(P<0.05)。4.3抑制IL-6后Vim的基因表达:qRT-PCR结果显示病毒28 d组的Vim mRNA表达较载体组明显下调(P<0.05)。结论1.在脊髓损伤的早期阶段IL-6的表达增加,在脊髓损伤的晚期阶段Vim的表达增加,实验结果提示SCI后IL-6和Vim影响大鼠后肢运动功能的恢复。2.用慢病毒介导的RNAi方法抑制炎症因子IL-6下调反应性胶质化相关因子Vim的表达,影响星形胶质细胞胶质化反应,将可能抑制胶质瘢痕形成,从而促进大鼠SCI后运动功能的恢复。