烟草病毒RT-PCR检测技术研究

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本文研究了RT-PCR检测TMV、CMV和PVY的技术方法:用保存在本研究室的TMV、CMV和PVY标准毒原,根据已经发表的烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的序列,人工合成引物,通过分别做TMV、CMV和PVY的单重RT-PCR,在1%琼脂糖上电泳,分别能扩增出1.44kb、739bp和780bp特异性条带,通过回收TMV、CMV的PCR产物进行测序和序列分析表明,扩增的TMV条带的核苷酸序列与已报道的TMV核苷酸序列同源性高达96.6%,扩增的CMV条带的核苷酸序列与已报道的CMV核苷酸序列同源性高达96%。表明我们所扩增的TMV和CMV条带是特异性的。 文章进行了CMV、TMV和PVY的多重RT-PCR研究,建立了同时检测TMV、CMV和PVY的RT-PCR检测体系,当两种病毒复合侵染和单独侵染的样本混合在一起,再进行扩增时,都能在一次PCR反应中,同时能扩增出两种病毒的相应特异条带,当三种病毒单独侵染的样本混合在一起,再进行扩增时,都能在一次PCR反应中,同时扩增出三种病毒的相应的特异条带。对TMV病毒的灵敏度检测可以达到1.25μg。 从广东省主要烟区梅州地区五华县和韶关地区南雄市,分别采集了烟草植株样本,通过采用鉴别寄主反应和RT-PCR方法,对其进行了鉴定。结果表明五华和南雄的烟草样品中都存在TMV和CMV,未检测到PVY。在检测样品中,表现为单独TMV阳性的样品占总样品的33.33%,单独CMV阳性的样品占总样品的22.22%,TMV、CMV都呈阳性占总样品的44.44%。
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