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地龙为临床常见动物源性中药材。地龙（Pheretima）有广地龙和沪地龙之分。广地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥体,沪地龙为通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）和栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。地龙性味咸,寒,具有清热定惊,通络,平喘,利尿之效,主治关节痹痛,半身不遂,肺热咳喘等症。临床常用于治疗脑卒中及其后遗症、哮喘、烫伤等症。现代研究表明地龙提取物具有抗炎、抗纤维化、抗肿瘤、神经保护等活性显著。我国常见有环毛蚓、爱圣蚓、远盲蚓等。然而,药典规定的地龙物种来源仅涉及其中四种。由于正品与伪品之间外观较为相似,导致目前尚未有方便、快捷的手段加以区分。另一方面,地龙质量评价手段较为简单,2020年版《中国药典》中仅有显微、薄层等鉴别手段,杂质和水溶性浸出物得率等质量评价手段。地龙化学成分复杂,主要含有氨基酸、核苷、嘌呤、碱基、肽及蛋白质类成分等,其抗凝血活性物质基础尚不明确,并且迫切需要更加科学、合理的手段对地龙进行质量评价。基于上述问题,本文以地龙抗缺血性脑卒中作为研究基础,整合DNA条形码、智能化注释结合人工解析、化学计量学和指纹图谱等技术,筛选广地龙与沪地龙差异性化学成分,明确地龙抗凝血活性物质基础,建立合理、科学的质量评价体系。具体实验如下:1.基于地龙DNA条形码技术对40批市售地龙饮片线粒体COⅠ基因进行测序分析,确认40批市售地龙中有5批参环毛蚓、11批通俗环毛蚓、4批褐色远盲蚓和6批保宁腔蚓等。2.基于超高效液相色谱串联单四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术采集地龙水提物质谱信息,整合GNPS、Met DNA智能化注释和人工注释,开展地龙质谱信息解析。依据参照文献、对照品信息,氨基酸类、二肽类、核苷类等化学成分裂解规律,从地龙提取物中成功鉴定出128个化学成分,包括33个氨基酸、22个二肽、20个生物碱、12个核苷、11个有机酸、5个磷脂和25个其它成分。3.基于UPLC-Q-TOF-MS技术采集15条参环毛蚓和27条通俗环毛蚓质谱信息,通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）的多元统计分析方法在正、负离子模式下分别识别出179个和155个变量,并指认出其中31个化合物,作为基原标志物。其中,腺苷、瓜氨酸等成分在参环毛蚓中含量较高,组氨酸和蔗糖在通俗环毛蚓中含量较高。基于网络药理学技术,预测基原标志物关联65个靶点和83条作用通路,确定参环毛蚓与通俗环毛蚓对LPA、LCN2、SOD2和AKT1的作用力存在异同,主要作用机制存在差异。4.通过正交实验设计对地龙进行提取工艺优化,确认温度40℃、超声功率220 W、超声时间40 min为其最佳提取工艺。通过高效液相色谱法检测,成功地建立40批市售地龙化学指纹图谱,并指认出次黄嘌呤、尿苷、苯丙氨酸、肌苷、鸟苷和色氨酸为其共有成分,并通过网络药理学分析可知6个共有成分可关联51个靶点作用缺血性脑卒中,确认6个共有成分可作为地龙活血化瘀功效关联质量标志物。通过建立次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、苯丙氨酸、肌苷、鸟苷、色氨酸和腺苷HPLC-DAD含量测定方法,并以“纤维蛋白原-凝血酶”滴定法评价地龙抗凝血活性,通过进行灰色关联分析和建立“含量-抗凝血活性”热图,确立尿苷、苯丙氨酸、鸟苷和色氨酸可作为地龙抗凝血活性质量标志物。根据95%置信区间方法,推荐地龙活血化瘀功效相关质量标志物总含量应不低于0.30%。