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盐度是影响硬骨鱼类生存,繁殖,生长,发育和生理功能的重要环境因素之一,会根据自然因素或人为因素发生变化,从而对鱼类造成渗透调节胁迫,影响其正常生长。军曹鱼(Rachycentron canadum)是一种广盐性硬骨鱼类,具有很高的市场价值。据报道,军曹鱼成鱼的盐度适应范围在22.5至44.5 ppt之间,但关于其幼鱼的适宜生存盐度范围及其潜在的盐度适应机制还知之甚少。鉴于此,本研究以军曹鱼幼鱼(全长13.70±0.91cm,体重9.74±0.85g)为实验材料,探究不同盐度对军曹鱼幼鱼存活、生长、生理生化指标及组织结构的影响;同时通过比较转录组分析,筛选鉴定与渗透压调节相关的差异表达基因,并挖掘与盐度适应相关的SNP位点;最后克隆与鱼类盐度适应相关的水通道蛋白AQP1和AQP3基因的cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术探究不同盐度条件下AQP1和AQP3基因在不同组织中的表达水平变化。论文取得的研究结果总结如下:1.盐度对军曹鱼幼鱼存活和生长的影响。在水温为26.5-28℃,溶解氧大于6mg/L的条件下,根据二点法,将30 d 70%死亡的盐度作为适宜存活临界盐度,将增长率为最佳增长率70%时所对应的盐度作为适宜生长临界盐度,最适存活盐度和最适生长盐度范围则为存活率或日生长率最高且差异不显著的几个实验组所对应的盐度范围。经统计分析,得出军曹鱼幼鱼(全长13.70±0.91cm,体重9.74±0.85g)的适宜存活盐度范围为3.68～37.43,最适存活盐度范围为10～34;适宜生长盐度范围为5.91～37.15,最适生长盐度范围为22～31。2.盐度对军曹鱼幼鱼血清渗透压、离子浓度及Na~+/K~+-ATP酶活性的影响。以正常海水盐度30为对照组,10盐度为低盐度组,35盐度为高盐度组,经过30d的养殖实验后发现盐度对军曹鱼幼鱼血清渗透压、Na~+和Cl~-含量的影响具有相似的变化趋势。低盐度组血清渗透压在第一天开始急剧下降,第二天达到最低点,之后逐渐上升并趋于稳定,但仍显著低于对照组(P<0.05);高盐度组血清渗透压在第一天开始升高,第二天达到最高点后开始下降,在各时间点均与对照组和低盐组有显著差异(P<0.05)。低盐度组Na~+含量在第二天达到最小值,之后逐渐上升并趋于平稳,各时间点Na~+含量显著高于对照组(P<0.05);高盐度组Na~+含量在第二天达到最大值,之后逐渐下降,第30d时与对照组相比已无显著性差异(P>0.05),但在其他时间点均存在显著性差异(P<0.05)。低盐度组Cl~-含量在第2d达到最小值,之后逐渐上升并趋于平缓,在第15d和第30d时血清中Cl~-含量与对照组相比已无显著性差异(P>0.05);高盐度组Cl~-含量在第2d达到最大值后逐渐下降并趋于稳定,与对照组和低盐度组差异显著(P<0.05)。盐度对军曹鱼Na~+/K~+-ATP酶活力的影响更为明显。低盐度组与高盐度组均在第2d时Na~+/K~+-ATP酶活力达到最大值,之后逐渐下降并趋于稳定,且低盐度组与高盐度组各时间点与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。3.盐度对军曹鱼幼鱼组织结构的影响。以正常海水盐度30为对照组,10盐度为低盐度组,35盐度为高盐度组,对军曹鱼幼鱼进行为期30d的养殖实验。发现低盐度适应后,鳃丝和鳃小片宽度增大,鳃小片间距缩小,泌氯细胞数量减少;而高盐度适应后,鳃丝和鳃小片宽度缩小,鳃小片间距增大,泌氯细胞数量增多。低盐度组的各级肾小管管径增大,肾小球膨大,饱满充盈,与肾小囊内壁间隙小于对照组;高盐度组肾小球萎缩,与肾小囊内壁间隙大于对照组。低盐度组单层柱状上皮厚度增大,杯状细胞数量减少,而高盐度组杯状细胞胞体直径增大,其他方面无明显变化。4.军曹鱼幼鱼盐度适应转录组学分析。以正常海水盐度30为对照组,10盐度为低盐度组,35盐度为高盐度组,经过30d的养殖实验后通过转录组测序技术对军曹鱼鳃、肾和肠组织进行测序分析。结果在军曹鱼幼鱼盐度适应转录组中获得了3,95,080,114个clean reads,这些clean reads组装成了65318个unigenes。其中N50大小为2758bp,在所有unigenes中共发现20,671个差异表达基因(DEG),包括低盐度条件下的8,805个差异表达基因和高盐度条件下的11,866个差异表达基因。这些DEGs在类固醇生物合成,不饱和脂肪酸代谢,谷胱甘肽代谢,能量代谢,渗透压调节和免疫反应中得到了显著的富集。鉴定的这些差异表达基因为研究军曹鱼盐度适应的分子机制提供了有价值的信息。通过各种基因和通路之间的相互作用使幼鱼机体发生了转录水平的变化,控制着对盐度变化的反应,调节细胞的其他功能,在应对盐度变化的同时也决定了军曹鱼盐度适应的分子策略。5.军曹鱼幼鱼转录组数据中盐度适应相关SNP的挖掘与分析在军曹鱼正常盐度、低盐和高盐转录组中,分别鉴定出了110453、110510和110216个SNP位点,转换分别占60.72%、60.71%和60.74%,颠换分别占39.28%、39.29%和39.26%。军曹鱼所有SNP位点分布于28511条SNP-unigene上,功能注释结果显示,总共有6480条SNP-unigene获得GO注释,13134条SNP-unigene获得KOG注释,5261条SNP-unigene获得KEGG注释。进一步富集分析显示,752个SNP-unigenes注释到“Tight junction”等多条盐度适应相关KEGG途径中;同时,根据SNP位点分布情况筛选到346个特异分布的盐度适应相关SNP位点。基于标准化的基因表达水平分析,在军曹鱼转录组差异表达基因中共检测到26295个SNP位点,分布于7936个差异表达盐度适应相关基因中。6.军曹鱼幼鱼盐度适应相关基因AQP1和AQP3的克隆及表达分析通过基因克隆技术得到的军曹鱼AQP1和AQP3基因cDNA序列的长度分别为741bp和744bp,分别编码246和247个氨基酸。BLAST分析显示其与高体鰤相似度较高,分别为90.65%和92.71%。实时荧光定量PCR检测结果显示,军曹鱼AQP1和AQP3在9种组织中均有表达,其中AQP1在肾中表达量最高,在肌肉中表达量最少,而AQP3在鳃中表达量最高,在脑中表达量最少。低盐适应后,AQP1基因在肾中表达量最高,肠次之,鳃最少;而高盐适应后AQP1基因与低盐适应的表达模式相同。AQP3基因低盐适应后在鳃中表达量最高,肠次之,肾最少;高盐适应后,AQP3基因在肠组织中表达量最高,肾次之、在鳃中表达量最少。综上所述,本研究以军曹鱼幼鱼为实验对象,一方面探讨了盐度变化对军曹鱼幼鱼存活、生长、生理生化及组织结构的影响;另一方面从分子水平上通过比较转录组分析,初步研究了军曹鱼幼鱼渗透压调节相关机制和盐度适应相关基因的转录调控规律;同时,研究了军曹鱼AQP1和AQP3基因的基因结构和表达水平,以期阐释军曹鱼盐度适应的生物学过程和分子调节机制,为鱼类盐度适应研究提供理论依据。