胚胎干细胞源性表皮干细胞构建组织工程皮肤的研究

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本研究包括以下四个部分:   第一部分bFGF对胚胎干细胞增殖的影响及ES细胞源性表皮干细胞分化潜能的研究1bFGF对小鼠ES细胞增殖的影响   方法:将E14小鼠胚胎干细胞分别培养于含LIF106U/L及含5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL3种浓度的bFGF的ES细胞基础培养液中,观察细胞形态和计数ES细胞克隆数。行碱性磷酸酶(AKP)和小鼠抗人胚胎阶段特异性抗原Ⅰ(stagespecificembryonicantigen,SSEA-Ⅰ)单克隆抗体染色鉴定10ng/mL培养3d的ES细胞。   结果:小鼠胚胎干细胞源性表皮干细胞在129小鼠肾被囊内4w,分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构,种植6w和8w,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样等结构。免疫组化汗腺样结构呈CEA和CK18阳性。   第二部分碱性成纤维细胞生长因子对大鼠骨髓间质干细胞增殖的影响   方法:用α-MEM冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬液,接种在塑料培养瓶中,经体外扩增、纯化,观察其生长特性,用免疫组织化学SABC法检测波形蛋白和纤粘连蛋白的表达,并研究不同浓度bFGF对骨髓MSCs生长曲线和克隆形成率的影响。   第三部分真皮支架材料的组织相容性研究   方法:将胶原、硫酸软骨素、透明质酸和甲壳糖按一定比例溶解,制备成复合凝胶,连同胶原海绵、明胶海绵三种真皮支架材料埋植入129小鼠皮下,术后3d、7d、10d、2w、3w、4w、5w、6w取材,形态学观察材料在体内的反应、血管化进程和降解速度等,评价其组织相容性。   第四部分ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建组织工程皮肤和体内移植研究1ES细胞源性表皮干细胞与类真皮组成皮肤类似物在皮下的分化。   
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