脑组织在遭受缺血后再恢复血流,往往会伴随出现缺血/再灌注损伤（I/R）引起神经细胞的凋亡。缺血再灌注损伤的机制也很复杂,涉及氧自由基大量产生、钙超载、线粒体通透孔开放、促凋亡因子的释放及明显的炎症反应等等。越来越多的研究表明,线粒体参与了缺血再灌注损伤的病理生理进程,缺血后的复氧可引起氧化应激水平的升高,抗氧化能力下降,导致线粒体损伤从而加重细胞凋亡。所以,靶向线粒体也许可以作为一种有效的治疗缺血再灌注损伤的神经保护策略。线粒体动力学作为线粒体融合与分裂之间的平衡,在细胞正常生理活动中发挥重要作用。线粒体融合可以使受损的线粒体DNA等其它组分与正常线粒体进行互补,因而维持正常的线粒体活性。从另一方面说,线粒体的分裂在控制线粒体质量的过程中可以有目的地分离和去除受损的线粒体以维持细胞内稳态。当凋亡信号刺激如DNA损伤、内质网应激、大量氧自由基发生时,会启动普遍的线粒体分裂并伴随线粒体脊的破坏和外膜通透（MOMP）增强,因而释放线粒体间隙促凋亡因子而启动凋亡程序。所以,线粒体动力学这一动态变化可能在缺血再灌注损伤的细胞凋亡中发挥着作用。在线粒体膜间隙中存在着一种重要的蛋白酶体HtrA2/Omi,HtrA2/Omi是HtrA家族的一员,具有丝氨酸蛋白酶水解活性。HtrA2/Omi可修饰或降解位于膜间隙中受ROS损伤的错误折叠蛋白。我们的前期研究中发现,应用H₂O₂诱导PC12发生氧化应激时可引起HtrA2/Omi高表达并通过与内膜融合蛋白OPA1的结合,破坏线粒体动力学平衡,促进线粒体点状聚集,诱导细胞凋亡的增多。但同时我们对HtrA2/Omi基因突变小鼠的脑皮质检测发现,HtrA2/Omi功能的缺失会引起OPA1长短体比例失衡,并引起线粒体嵴结构消失导致细胞凋亡的增加。可见,蛋白酶HtrA2/Omi如何调控线粒体动力学参与神经细胞凋亡的机制并不清楚。我们注意到,位于线粒体内膜的解偶联蛋白2（UCP2）,当发生脑缺血再灌注损伤时,激活UCP2的表达,通过增加NAD⁺/NADH的比例,从而加速底物的氧化,减少氧化还原反应中产生的ROS。目前有研究发现,在培养的近端肾小管上皮细胞中,UCP2缺失的细胞可诱导线粒体分裂加剧,导致细胞凋亡的增加。这提示我们UCP2也可能参与调控线粒体动力学影响细胞凋亡。但也有文献报道,对C57小鼠给予京尼平,一种UCP2的抑制剂,可以有效改善脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡,可见解偶联蛋白UCP2在缺血再灌注损伤时发挥的具体作用机制仍不明晰。于是我们推测发生氧化应激损伤时,UCP2可能通过线粒体动力学参与调控细胞凋亡。在本研究中,我们希望通过对HtrA2/Omi基因突变小鼠使用UCP2抑制剂京尼平预处理,复制脑缺血再灌注损伤模型,观察线粒体动力学改变,探讨HtrA2/Omi协同UCP2调控线粒体动力学在脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法:1.将小鼠随机分为8组:野生型假手术组（WT sham）,野生型缺血1.5h再灌注24h组（WT I/R-1.5h）,杂合子假手术组（HtrA2^Heteroetero sham）,杂合子缺血1.5h再灌注24h组（HtrA2^Heteroetero I/R-1.5h）,京尼平预处理野生型假手术组（WT sham G+）,京尼平预处理野生型缺血1.5h再灌注24h组（WT I/R-1.5h G+）,京尼平预处理杂合子假手术组（HtrA2^Heteroetero sham G+）,京尼平预处理杂合子缺血1.5h再灌注24h组（HtrA2^Heteroetero I/R-1.5h G+）,各组6只。京尼平预处理指按照40 mg/kg体重对小鼠腹腔注射京尼平,隔日一次,持续两周,之后再行假手术或缺血1.5h再灌注24h的MCAO模型。2.通过TTC、TUNEL染色、凋亡相关蛋白表达变化,评估各组小鼠脑梗死面积及细胞凋亡水平。3.检测各组SOD活力、MDA含量,评估氧化应激水平。检测各组未折叠蛋白反应相关蛋白HSP90变化评价线粒体损伤程度。检测线粒体分裂（Fis1、Drp1）融合（Mfn1、Mfn2）蛋白及基因水平变化,评估线粒体动力学改变。结果:1.TTC染色显示,HtrA2^Heteroetero I/R梗死面积明显大于WT I/R组;但京尼平预处理后,WT与HtrA2^Hetero在I/R后的梗死面积均减少。TUNEL染色显示HtrA2^Hetero缺血组与WT缺血组分别与未给京尼平模型组相比,细胞凋亡数目均明显减少。2.与WT I/R1.5h组相比,HtrA2^Hetero缺血再灌注损伤后促凋亡相关蛋白Bax与抑制凋亡相关蛋白Bcl-2比值显著增高。而给予京尼平腹腔注射后,虽然I/R后促凋亡相关蛋白Bax与抑制凋亡相关蛋白Bcl-2比值仍升高,但升高程度明显减弱,以HtrA2^Hetero缺血再灌注损伤后最为明显,同时,HtrA2^Hetero缺血组与WT缺血组相比,Bax/Bcl-2比值无显著性差异。3.与WT I/R组相比,HtrA2^Hetero组SOD活力下降更显著,脂质氧化MDA水平升高更明显。给予京尼平后,与WT假手术组相比,WT I/R组抗氧化酶SOD活力上升,MDA无明显变化。4.I/R后会引起HSP90蛋白表达下降,且HtrA2^Heteroetero I/R组下降更为明显。而京尼平预处理后,I/R后WT无明显的下降,同时HtrA2^Hetero进一步出现了表达明显上升。5.发生I/R后,WT的Fis1及Drp1的mRNA及蛋白表达水平均增加,Mfn1及Mfn2的mRNA及蛋白表达水平下降。京尼平预处理后,Drp1的mRNA水平升高,Fis1的mRNA及蛋白表达水平下降,Mfn1的mRNA表达水平下降而蛋白表达稍有升高、Mfn2的mRNA及蛋白表达水平下降。6.发生I/R后,HtrA2^Hetero的Fis1及Drp1的mRNA及蛋白表达水平均增加,Mfn1及Mfn2的mRNA及蛋白表达水平下降。京尼平预处理后,HtrA2^Heteroetero I/R组Fis1及Drp1的蛋白表达显著下降,Mfn1、Mfn2的mRNA及蛋白表达下降。结论:1.给予京尼平后TTC染色梗死面积及细胞凋亡水平的下降,提示京尼平通过抑制I/R后的细胞凋亡,减轻HtrA2/Omi功能缺失导致的脑皮质损伤。2.发生脑I/R时,京尼平可能通过提高HSP90的表达,抑制线粒体融合分裂蛋白的表达,减轻HtrA2/Omi功能缺失时引起的线粒体损伤。3.发生脑I/R时,京尼平对HtrA2/Omi突变小鼠线粒体融合可能具有抑制作用。4.京尼平抑制UCP2的同时,可能也减少I/R后的线粒体分裂。所以,蛋白酶HtrA2/Omi可能协同UCP2调控线粒体动力学,减少线粒体损伤引起的细胞凋亡,以抵抗脑缺血再灌注损伤。