近年来，厌氧生物制造因其原子经济性高、能耗低、部分产品可固定CO2等优点引起了广泛关注。德国BASF、美国BioAmber、荷兰DSM、日本三菱、中国石化等国内外知名企业竞相研发厌氧生物基大宗化学品的制备技术。丁二酸、苹果酸是典型的厌氧C4平台化合物，在利用分子生物学技术改造大肠杆菌中心代谢途径制备C4有机酸的过程中，往往出现胞内NAD(H)合成能力减弱、NADH/NAD+比例失衡等问题，从而导致菌体生长缓慢、产物合成能力减弱，甚至丧失在厌氧条件下的生长及代谢能力。因此开展菌株NAD(H)系统的改造与调控对实现厌氧还原性产物高效合成具有极其重要的理论意义与实际应用价值。本论文以丁二酸大肠杆菌生产菌株为研究对象，综合利用分子改造与发酵调控相结合的手段，采用胞内胞外共调节的方法，提高物质代谢过程中NAD(H)总量并维持适宜菌株生长与产物合成的NADH/NAD+比例，从而恢复菌株厌氧条件下的生长及代谢能力，进而提高丁二酸的生产效率。本论文主要研究工作分述如下:　　(1)建立了基于NAD(H)系统的厌氧生长代谢改造策略，构建了具有厌氧生长与丁二酸代谢合成能力的重组大肠杆菌。　　野生型大肠杆菌以乳酸、甲酸和乙酸等为主要代谢产物，通过敲除乳酸脱氢酶(LDH)的编码基因（ldhA）和丙酮酸-甲酸裂解酶(PFL)的编码基因（pflB），重组大肠杆菌C4有机酸合成代谢通量大幅提高。然而在厌氧条件下，菌株由于LDH和PFL的失活使NADH不能及时再生为NAD+，导致辅酶NADH/NAD+比例失衡（上升），NAD(H)合成能力减弱，并使其丧失了厌氧葡萄糖代谢的能力。　　①重组大肠杆菌NAD+再生强化　　以敲除了ldhA和pflB基因的重组大肠杆菌NZN111为出发菌株，构建过量表达NADH依赖型苹果酸脱氢酶(MDH)的重组大肠杆菌NZN111/pTrc99a-mdh，强化NAD+再生能力并降低NADH/NAD+比例，恢复了大肠杆菌厌氧生长及目标产物合成代谢能力。通过3-L厌氧发酵罐发酵，48 h消耗了13.5 g/L的葡萄糖生产了4.3 g/L的丁二酸。　　②重组大肠杆菌NAD(H)生物合成途径改造　　利用分子生物学手段，调控表达NAD(H)合成途径中的一个或多个基因(pncB、nadD和nadE)，解除合成限速步骤(pncB及nadD)，有效提高了菌株胞内的NAD(H)总量，同时降低NADH/NAD+比例，从而恢复了大肠杆菌厌氧生长及目标产物合成代谢能力。　　(2)考察了重组大肠杆菌在不同NAD(H)系统改造方式及不同还原性碳源条件下的NAD(H)合成代谢变化规律，揭示了辅酶NAD(H)代谢调节碳物质代谢的作用机制。　　利用上述的不同NAD(H)系统改造方式皆能提高胞内NAD(H)总量，降低NADH/NAD+比例，而随着NADH/NAD+比例的降低，细胞生长速率、葡萄糖消耗速率和丁二酸合成能力也随之提高。其中，共表达pncB和nadD基因的CA102，NADH/NAD+比例最低且其细胞干重和丁二酸浓度为最高。厌氧发酵48 h消耗22.0 g/L的葡萄糖生产了9.4 g/L的丁二酸，丁二酸浓度与出发菌相比提高了4.5倍。　　利用不同还原性碳源进一步调节重组大肠杆菌胞内还原力水平，利用还原性较强的山梨醇发酵时其细胞生长速率和丁二酸生产强度最高。当不同菌株之间的NADH/NAD+比例相当时，NAD(H)总量越高，细胞生长速率和丁二酸生产强度越高。此外，NAD(H)的合成受到NADP合成代谢的间接调控，当NAD(H)浓度到达一定值时，NADP(H)合成能力显著提高而NAD(H)总量不再明显上升。　　(3)通过基于NAD(H)系统调节的C4合成代谢强化，提高了厌氧生物转化的代谢速率与产物得率。　　通过NAD(H)系统改造恢复了大肠杆菌厌氧生长及产物合成代谢能力，但是C3至C2合成途径的代谢流并没有因此减少，为进一步提高C4合成途径代谢流通量，通过引入外源CO2固定关键酶，减少丙酮酸积累，提高流向丁二酸的代谢流通量。结果表明，共表达NAD(H)合成途径的pncB基因和来源于Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000的pyc基因的E.coli CA014，NADH/NAD+比例下降到0.04，副产物丙酮酸积累量降低，丁二酸得率和生产强度分别达到0.71 g/g和0.22 g/(L·h)，与单表达pncB基因的CA001相比皆明显提高。　　(4)利用胞外氧化还原电位调节胞内NAD(H)总量及NADH/NAD+比例，建立了基于NAD(H)系统调节的厌氧生物调控策略。　　为提高菌株合成培养基（无机氮源）生长代谢能力，以E.coli CA014为出发菌株，通过ARTP菌种选育，成功筛选到一株厌氧条件下能够利用合成培养基代谢生长的产丁二酸菌株LL016。同时，通过胞外氧化还原电位(ORP)调控考察了在不同ORP水平时LL016胞内NAD(H)总量、ATP水平、关键酶活力和代谢流分布，结果表明通过添加1 g/L的铁氰化钾作为氧化剂或者添加1g/L的二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂进行调控ORP维持在-400 mV时，与-200 mV和-300mV相比，较高NADH供给和激活的MDH能够提高丁二酸的生产效率、OAA的代谢速率和CO2的固定速率，丁二酸的浓度和生产强度分别达到28.6 g/L和0.33 g/L/h。此外，通过分析ORP调控对代谢流分布的影响，结果表明在不同的ORP水平，NADH/NAD+比值变化明显，从而导致代谢流分布发生变化，进而引起了碳物质代谢的较大变化。