研究背景:新生儿血脑屏障功能不完善,中枢神经系统易受围生期感染因素的影响引发炎症反应,增加新生儿死亡风险。中枢神经系统由多种细胞构成,其中星形胶质细胞占有重要地位,它对维持中枢神经系统结构和功能的完整性至关重要。星形胶质细胞不仅可以为神经细胞提供支持保护的作用,还与血脑屏障形成、离子物质代谢、神经元迁移、突触形成、髓鞘形成以及神经递质的传递有关。当星形胶质细胞出现异常时往往会造成神经损伤给大脑带来严重的损害。在大脑的发育过程尤其是婴幼儿的大脑发育过程中,由外部感染引起的脑部炎症会促使星形胶质细胞发生改变,从而影响其正常功能,进而对大脑的发育造成严重损害,这对处于大脑发育关键期的婴幼儿的成长是十分不利的。叶酸作为一种维生素,在生物体中发挥着多种功能,它不仅参与氨基酸的代谢循环,对于基因的转录和蛋白质的翻译也有着很重要的作用。以往的研究发现它可以有效地预防卵巢癌、肝癌、肠胃癌、贫血症、神经管畸形等疾病,近年来还发现它具有抗炎的功能,在生物机体的免疫调节方面发挥着重要作用。但是,它在星形胶质细胞炎症反应中的作用机制还不是很清楚,还需要人们进一步的探索与发现。本课题中,我们体外脂多糖(LPS)处理原代星形胶质细胞,以及在体构建新生儿脑部炎症模型,分别从体内体外模拟星形胶质细胞炎症反应,旨在研究叶酸在星形胶质细胞炎症反应中的作用及分子机制。研究目的:通过使用体内体外星形胶质细胞炎症反应模型,研究叶酸对星形胶质细胞炎症反应的影响。探究叶酸在星形胶质细胞炎症反应中的作用机制。研究方法:一是体外诱导星形胶质细胞炎症反应。获取并培养P3小鼠原代星形胶质细胞,验证星形胶质细胞纯度,并检测叶酸对星形胶质细胞炎症反应的作用。首先用MTT法观察不同浓度的叶酸对原代星形胶质细胞活性的影响,然后在不同时刻用LPS(1μg/ml)刺激原代星形胶质细胞,观察LPS刺激下原代星形胶质细胞分泌的几种炎性因子的变化情况,发现它们在LPS刺激的不同时刻的表达不同,我们筛选出变化最明显的时段,确定LPS刺激的最佳作用时间。进而观察不同浓度的叶酸对于LPS刺激的星形胶质细胞中炎性因子变化的影响,以确定所使用的最佳叶酸浓度。而后检测GFAP的变化情况以及此过程中涉及到的相关信号通路以及表观遗传修饰的变化,最后在体内再做进一步的验证。实验过程中涉及到的实验方法有MTT细胞活性检测实验技术、mRNA提取技术、qPCR技术、Western blot技术、免疫荧光技术、冰冻切片技术、SPSS分析技术等。二是新生鼠脑部炎症模型的构建。我们选用出生后3天(P3)的C57BL/6小鼠,通过腹腔内注射0.6mg/kg的LPS,注射2h后检测大脑皮层炎性因子IL-1β、iNOS、TNF-α表达的变化。同时使用4mg/kg的叶酸进行腹腔内注射,2h后检测叶酸对炎症反应的作用。主要通过qPCR技术、Western blot技术、免疫荧光技术等技术从mRNA和蛋白水平进行检测。研究结果:叶酸在LPS诱导的原代星形胶质细胞炎症反应中的作用。体外实验发现低浓度叶酸(5(μg/ml)对于细胞活性没有毒性影响,在以1μg/ml的LPS刺激原代取材星形胶质细胞后,检测到细胞内炎性因子TNF-α、iNOS、IL-1β的表达在2h到24h都会提高,变化最明显的时间段出现在LPS刺激12h左右,而LPS刺激后的24小时所引起的炎性反应相对减弱。叶酸有减缓LPS刺激引起的星形胶质细胞炎症反应的作用,并且随着叶酸的使用浓度增大相应的炎性因子降低越发明显。LPS刺激后,炎性因子TNF-α、iNOS、IL-1β的mRNA表达上升明显,GFAP的蛋白表达上升明显,NF-kB信号通路激活明显,EZH2和H3K27Me3的表达增加,在使用50μg/ml的叶酸后,炎性相关因子下调,GFAP表达量减少,NF-kB信号通路的激活得到抑制,表观遗传调控因子EZH2以及它的下游基因H3K27Me3的表达量减少。叶酸在LPS诱导的新生鼠脑部炎症反应中的作用。叶酸在新生鼠脑部炎症中的作用与体外实验结果一致,在使用0.6mg/kg的LPS腹腔注射处理两小时后,炎性因子TNF-α、iNOS、IL-1β表达上调,GFAP阳性细胞数目增加,NF-kB信号通路得到激活,EZH2和H3K27Me3的表达量增加。4mg/kg的叶酸与LPS同时腹腔注射使用则会明显减弱LPS导致的炎症反应症状。研究结论:叶酸可以有效地缓解LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应,减少LPS刺激所导致的炎性因子的分泌以及GFAP的表达,主要是通过调控NF-kB信号通路以及表观遗传因子EZH2实现,起到保护星形胶质细胞免受LPS引起的致炎作用。研究意义:通过研究叶酸在LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应中的作用,能够加深对叶酸功能的了解,有利于发掘叶酸的更大药用价值。同时通过构建新生儿脑部炎症进一步验证了叶酸在星形胶质细胞炎症反应中的作用,从而为人类新生儿脑部炎症的治疗提供新的治疗参考。