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第一部分血管紧张素Ⅱ预处理对骨髓间充质干细胞心肌缺血保护作用的影响目的:干细胞移植治疗心肌梗死是一项有前景的治疗方法。有报道称,用生长因子组合预处理骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)可以有效地提高干细胞移植治疗心梗的疗效。而血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)可以激发MSCs旁分泌生长因子的能力。因此,本实验旨在研究Ang Ⅱ预处理对MSCs治疗心肌梗死疗效的影响及其机制。方法:MSCs和内皮细胞(Endothelial cells,ECs)提取自Sprague–Dawley(SD)大鼠。MSCs接受100 n M Ang Ⅱ预处理24小时后,移植到大鼠心肌缺血周边区。移植30天后,检测心功能、心肌纤维化程度、心梗面积、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表达、血管新生、MSCs分化等指标。用流式细胞术检测缺氧处理后MSCs凋亡的情况;小管形成实验检测MSCs的血管新生活力。免疫荧光和Western blot检测细胞缝隙链接蛋白43(Connexin 43,Cx43)的表达。结果:与普通MSCs组相比,移植经Ang Ⅱ预处理的MSCs治疗效果更好,包括心功能改善、心肌纤维化程度降低、心梗面积减小,VEGF和VⅡI因子表达的增高;但是MSCs向心肌细胞的分化并没有被提高。Ang Ⅱ预处理提高了MSCs的生存率以及与MSCs混合培养的H9c2细胞的生存率。Ang Ⅱ预处理提高了ECs和MSCs的体外小管形成能力。Ang Ⅱ预处理还提高了MSCs中Cx43的表达。结论:Ang Ⅱ预处理提高了MSCs治疗心肌梗死的效果,其机制包括提高了MSCs旁分泌生长因子的能力、新生血管的能力、形成缝隙连接的能力。第二部分Ace2基因过表达对骨髓间充质干细胞心肌保护作用的影响目的:MSCs移植治疗心肌梗死是临床研究的热点,但是其治疗效果还不理想。心梗心肌局部恶劣的微环境阻碍了干细胞发挥治疗效果。血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)是近年来发现的肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)系统的新成员,它可以抗衡血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)激活带来的损伤作用。本实验旨在研究以MSCs作为基因治疗的载体,提高ACE2在心肌中的表达对长久改善心肌微环境以及治疗心肌梗死效果的影响。方法:MSCs和ECs提取自SD大鼠。用RT-PCR和Western blot检测细胞ACE2的表达;用免疫组化检测组织ACE2的表达。用酶反应荧光试剂盒检测细胞和组织中ACE2的活性。CCK-8法检测慢病毒感染对MSCs增殖的影响。用放射免疫试剂盒检测Ang Ⅱ浓度;用酶联免疫试剂盒检测血管紧张素1-7(Angiotensin1-7,Ang-(1-7))浓度。超声心动图评价心功能,TTC染色检测心梗面积。天狼星红染色检测心肌胶原沉着。Hoechst染色试剂盒检测H9c2细胞凋亡。小管形成实验检测MSCs血管新生活力。Western blot检测MSCs中RAS反应元件和相关蛋白的表达。蛋白芯片检测MSCs旁分泌生长因子能力。RNA-seq高通量测序获得基因差异表达信息。结果:移植过表达ACE2的MSCs治疗心肌梗死比移植单纯的MSCs治疗效果更好,表现为大鼠心功能显著改善、心梗面积降低、心肌局部胶原沉着减少,ACE2活性升高。体外实验研究显示,MSCs本身几乎不表达ace2基因,慢病毒转染后,ACE2表达显著升高,活性显著增强,合成的Ang-(1-7)水平显著升高。ACE2过表达对MSCs的增殖有微弱的抑制作用。ACE2过表达提高了与MSCs共培养的H9c2细胞的耐缺氧能力。MSCs的RAS及其相关关键分子中,ACE2表达显著升高,ACE表达变化不显著,血管紧张素I型受体(Angiotensin Ⅱ type1-receptor,AT1)受体表达显著降低;一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)1表达变化不显著,NOS3表达升高,STAT3表达变化不显著,VEGF表达显著降低。结论:MSCs是一种良好的基因治疗的细胞载体,过表达ACE2的MSCs通过将Ang Ⅱ转化为Ang-(1-7),发挥了保护作用;同时还引发了RAS多种反应元件及其相关信号通路蛋白的改变,对MSCs生物学功能产生影响,有益于改善心梗心肌局部微环境。综上所述,本研究的创新之处在于:首次系统地研究了Ang Ⅱ药物预处理MSCs对其移植治疗心肌梗死的影响和机制;首次系统地研究了MSCs过表达ace2基因对其移植改善心肌微环境、治疗心肌梗死的影响和机制。本研究的结果,为干细胞的临床研究提供了有力的实验证据。