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灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallen)是亚洲稻区水稻上常见的重要害虫之一,主要通过取食水稻和传播水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)为害。RSV在传播介体灰飞虱体内增殖需克服多重屏障,需通过与介体蛋白互作以完成其复制,前期研究发现带毒灰飞虱体内电压依赖型阴离子通道(Voltage-dependent anion-selective channel,VDAC)表达水平显著高于不带毒灰飞虱,然而VDAC在传播RSV病毒中的互作机制仍不明确。为此,本研究利用多种手段证明了 VDAC与RSV的互作,并探讨了 VDAC在RSV传播中的角色。田间灰飞虱的防治主要依靠化学防治,农药处理会引起灰飞虱体内各种生理生化水平发生变化,部分亚致死剂量的农药还会引起灰飞虱的再猖獗,同时也可能刺激灰飞虱体内RSV的增殖,化学农药某种程度上影响了灰飞虱及RSV在田间的发生水平。我们已有研究证实了亚致死浓度的三唑磷在刺激灰飞虱产卵、卵黄蛋白(vitellogenin,Vg)及卵黄蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)表达上调的同时,卵巢内RSV的表达水平和子代灰飞虱的带毒率也随之上升。VDAC与RSV在灰飞虱卵巢内存在互作,VDAC作为线粒体外膜上的“看门人”,控制着细胞凋亡。为了科学评价井岗霉素、多菌灵、吡虫啉和三唑磷处理后对灰飞虱生殖的影响,是否会引起田间灰飞虱的再猖獗,为此我们分析研究了四种农药处理灰飞虱后,VDAC与凋亡相关基因在卵巢中表达水平变化以及VDAC在引起再猖獗中的功能。从细胞凋亡角度解释了部分农药引起再猖獗的原因,这将有助于指导田间农药的选择与施用方法,并提前制定相应的对策,从而控制灰飞虱和RSV的传播。1.VDAC与RSV的互作相对定量结果表明,VDAC在灰飞虱不同发育阶段均表达,高龄若虫表达量开始上升,到羽化后4天最高,而后开始下降,带毒和不带毒趋势一样,带毒灰飞虱同龄期表达量高于不带毒灰飞虱,表明RSV侵染灰飞虱刺激VDAC的表达。带毒灰飞虱中RSV外壳蛋白CP(Capsid protein)和RNA3(RNA3 segment)均在成虫阶段低表达,而在若虫阶段高表达。VDAC和RSV均在灰飞虱卵巢内高度表达,免疫荧光检测各组织中均可标记到VDAC与RSV。注射dsVDAC 48h后对VDAC和RSV的抑制效果最为明显,qRT-PCR结果显示,VDAC表达水平在唾液腺,中肠,卵巢和血淋巴四个组织中分别下降46.82%,36.51%,62.88%,89.29%,RNA3 的表达水平分别下降 71.18%、42.31%、67.74%、63.43%。结果暗示着VDAC与RSV间存在互作,沉默VDAC后唾液腺、中肠和卵巢中VDAC和RSV荧光信号均显著减弱,且存在部分共定位。酵母双杂交实验表明,VDAC与RSVRdRp蛋白间存在互作。2.VDAC对几种农药处理的响应机制Lscaspase-1a在雌性灰飞虱中表达量最高,分别是Nc亚型的45.75倍,1c亚型的3.48倍,8亚型的2.67倍。沉默VDAC后,整头虫VDAC的表达水平下降84.05%,Vg下降18.33%,除Lscaspase-8外其他三种凋亡相关基因均显著下降;卵巢中VDAC下降72.68%,Vg下降31.13%;血淋巴中VDAC和4种凋亡相关基因表达均显著下调,表明抑制了 VDAC表达后可能会影响灰飞虱的生殖和细胞凋亡。吡虫啉LC10浓度下带毒灰飞虱产卵数显著增加,吡虫啉LC10和三唑磷LC30浓度可显著刺激Vg和VDAC的表达,且下游凋亡相关基因Lscaspase也随之上升,表明灰飞虱卵巢内Vg表达上升的同时其细胞凋亡也同时加剧。选取的两种杀菌剂—100 ppm井岗霉素抑制Vg表达,200ppm多菌灵刺激Vg表达,但4种caspase对二者响应均不显著。分别对羽化4D、10D的卵巢进行TUNEL染色,发现吡虫啉和三唑磷处理组凋亡细胞数均多于对照组,且吡虫啉处理羽化4D卵巢凋亡率显著上升。