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肺纤维化以成纤维细胞增生、细胞外基质沉积为特点，见于许多间质性肺疾病的晚期，导致器官功能失调。肺纤维化反应表现为成纤维细胞数量的明显增加，细胞外基质转换失衡，一般认为是一种不可逆的过程。在疾病早期可有富含结缔组织的蛋白沉积和基底膜破坏。在IPF的纤维化过程中，肺局部微环境中细胞外基质合成与代谢失衡可能是至关重要的发病机制。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组降解细胞外基质的主要酶系，是锌离子依赖的、具有共同结构区的内肽酶超家族。MMPs的催化活性主要受其特异性抑制剂控制，称为基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）。在纤维化形成过程中，存在着这种修复机制的失衡。目前关于肺纤维化的治疗药物包括皮质类固醇、环磷酰胺和氨甲喋呤等，其治疗价值有限，寻找新的有效的抗纤维化药物是亟待解决的问题。实验研究中，他汀类药物一尿羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-COA）还原酶抑制剂用于动物动脉硬化和肾小球硬化的治疗取得较好效果。各种研究显示他汀类药物可通过抑制基质金属蛋白酶、干预成纤维细胞增殖、胶原合成、参与调节细胞外基质的降解，可能具有抗纤维化作用，但目前直接进行体内观察其抗肺纤维化作用的研究并不多。目的本研究观察阿托伐他汀对博莱霉素（bleomycin，BLM）诱导的大鼠实验性肺纤维化的形成过程是否具有保护作用，观察阿托伐他汀对肺纤维化大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1表达的影响，初步探讨阿托伐他汀抗肺纤维化的机制。基于成纤维细胞在肺纤维化形成中的作用以及是分泌基质金属蛋白酶的关键细胞之一，观察阿托伐他汀对其干预作用及其分泌的MMP-9、TIMP-1的影响，为探讨阿托伐他汀抗肺纤维化作用的机制提供实验依据。材料与方法博莱霉素气管内注入制备大鼠肺纤维化模型，分为模型2、4、6周组（M2、M4、M6），阿托伐他汀亦按干预时间分为2、4、6周组（A2、A4、A6）。通过大体标本、肺泡灌洗液（BALF）、病理切片HE染色、Masson染色、酸解法测定肺组织羟脯胺酸的含量等方法，观察肺泡炎、肺纤维化的情况。Gelatin Zymography明胶酶谱分析BALF的MMP-9活性；ELISA检测肺泡灌洗液、血清中MMP-9、TIMP-1的浓度；RT-PCR检测肺组织MMP-9、TIMP-1mRNA的表达；Western-blot检测肺组织MMP-9、TIMP-1的蛋白表达。博莱霉素制备大鼠肺纤维化模型，1周后处死，提取肺成纤维细胞，阿托伐他汀进行干预。MTT法测定细胞存活率；底物酶谱法分析Ⅳ型胶原酶的分泌及活性；[3H]-脯氨酸渗入评价脯氨酸含量的变化；RT-PCR检测细胞分泌的MMP-9、TIMP-1mRNA的表达；Western-blot检测细胞培养液中MMP-9、TIMP-1、胶原Ⅳ、纤维连接蛋白的蛋白表达。结果阿托伐他汀对博莱霉素致大鼠肺纤维化有一定的保护作用，各治疗组的肺间质纤维化程度较相应的BLM组均有减少，其中A4组（0.50±0.32）较M4组（0.81±0.25）、A6组（0.19±0.24）较M6组（0.76±0.18）比较具有显著性差异（P＜0.01），A2组与M2组比较虽无统计学意义，但仍有减少的趋势。HE染色、Masson染色显示：阿托伐他汀各组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度较同时期模型组明显减轻，尤其是6周治疗组，肺泡间隔增厚程度明显减少，虽仍可见成纤维细胞增生，胶原增多，但纤维化面积及病灶明显缩小。阿托伐他汀对肺纤维化大鼠肺组织羟脯胺酸的影响结果显示：从2周开始，BLM组大鼠肺组织HYP就明显高于对照组，而BLM组之间HYP的含量有下降的趋势；阿托伐他汀组则从2周开始低于相应的BLM组，HYP呈降低趋势，表明阿托伐他汀对HYP的合成有一定的的抑制作用。阿托伐他汀对肺纤维化大鼠血气的影响：BLM各组与对照组比较，PaO2均下降，尤其是2周BLM组，此时模型处于肺泡炎阶段。各治疗组与同期的BLM组相比，PaO2均有不同程度的升高，尽管仍低于对照组，但随着治疗时间的延长，PaO2越来越接近对照组，说明阿托伐他汀可改善肺纤维化大鼠的氧合功能。BALF中细胞总数和分类计数显示M2、A2组BALF细胞总数及中性粒细胞有增高趋势，但统计学无显著性差异。Gelatin Zymography明胶酶谱分析BALF中MMP-9活性显示：各组BALF均可使明胶底物分解。2周、4周模型组的MMP-9活性均高于对照组（P＜0.01），2周组活性最高。随着肺纤维化的进程，MMP-9的活性逐渐下降，6周组与对照组相比较无明显统计学差异。阿托伐他汀处理组的MMP-9活性受到一定程度阻断，尤其是阿托伐他汀处理的2周组MMP-9活性下降最明显。而6周组与模型组比较虽有下降的趋势，但并无统计学意义。ELISA分析BALF中MMP-9、TIMP-1的浓度显示：博莱霉素致大鼠肺纤维化的进程中，BALF中的MMP-9的浓度肺泡炎阶段（2周）最高（P＜0.01），后逐渐下降，但均高于对照组。而阿托伐他汀各组分泌的MMP-9均有降低，但仍高于对照组。说明阿托伐他汀对肺组织分泌的MMP-9有抑制作用。但血清中的MMP-9模型组及阿托伐他汀组均无明显统计学差异，故阿托伐他汀对系统分泌的MMP-9无影响。博莱霉素致大鼠肺纤维化的进程中，2-6周内BALF中的TIMP-1的浓度逐渐升高（P＜0.01）。而阿托伐他汀干预的各组分泌的TIMP-1均有降低。说明阿托伐他汀对肺组织TIMP-1的分泌有抑制作用。但血清中的TIMP-1在模型组及阿托伐他汀组较对照组均无明显统计学差异，故阿托伐他汀对系统分泌的TIMP-1影响不大。RT-PCR显示：正常对照组、博莱霉素2周、4周、6周组肺组织匀浆中均有MMP-9、TIMP-1mRNA的表达。与对照组比较，模型组在2周MMP-9、TIMP-1mRNA基因转录水平均显著增高，尤以MMP-9增加明显，在4周、6周时，MMP-9已有所降低，但TIMP-1 mRNA表达仍持续性增高。与模型组比较，治疗组第2周MMP-9、TIMP-1 mRNA基因转录水平降低，尤其是MMP-9的表达降低更为明显，在4周、6周时这种降低作用仍持续存在。Western blot结果显示：正常对照组、博莱霉素2周、4周、6周组肺组织匀浆中均有MMP-9、TIMP-1蛋白的表达。与对照组比较，模型组在2周MMP-9、TIMP-1蛋白表达均显著增高，在4周时，MMP-9已有所降低，但TIMP-1蛋白表达仍持续性增高，直至第6周才有下降的趋势。与模型组比较，各治疗组MMP-9、TIMP-1蛋白表达水平均降低。细胞培养MTT显示：阿托伐具有显著抑制成纤维细胞增殖的作用，与对照组比较，1μM的阿托伐他汀组的细胞数降至78.5±8％（P＜0.01），5μM组的细胞数降至49.8±12.6％（P＜0.001），10μM组的细胞数降至36.1±10.7％（P＜0.001），0.01μM和0.1μM的阿托伐他汀对细胞的抑制与对照组相比较无显著的差异，分别为98.3±10.8％（P=0.35），92.2±8.4％（P=0.13）。Gelatin Zymography明胶酶谱分析结果表明：暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小时的肺成纤维细胞分泌的MMP-9分别减少至（79.11±14.39）％（P=0.1）和（56.74±12.98）％（P＜0.01），而MMP-2分别为（103.90±5.46）％，（79.07±16.75）％；后者虽有下降趋势但并无统计学意义。Western blot分析细胞培养液中MMP-9、TIMP-1酶活性示：暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小时的肺成纤细胞分泌的MMP-9分别减少至（84.67±11.74）％（P=0.31）和（29.15±6.03）％（P＜0.05）。TIMP-1分别减少至（48.89±1.92）％（P＜0.01）和（30.37±2.80）％（P＜0.001）。Western blot显示暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小时的肺成纤细胞分泌的胶原Ⅳ分别减少至65.9±9.32（P＜0.05）、42.6±8.5％（P＜0.01）。与之类似，暴露于5μM的阿托伐他汀72小时的肺成纤细胞分泌的纤维连接蛋白减少至对照组的20.6±4.2％（P＜0.01）。[3H]-脯氨酸渗入结果显示：1μM的阿托伐他汀减少脯氨酸的结合至77.1±15.0％（P＜0.05），5μM的阿托伐他汀减少至54.7±6.6％（P＜0.05）。RT-PCR分析阿托伐他汀对成纤维细胞的MMP-9、TIMP-1的mRNA表达的影响结果显示，不同浓度的阿托伐他汀处理肺纤维化成纤维细胞72h后MMP-9、TIMP-1 mRNA表达均减少（P＜0.05）。结论1．阿托伐他汀可减轻博莱霉素所致大鼠的肺纤维化。2．阿托伐他汀抑制博莱霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织的MMP-9、TIMP-1的合成及分泌。3．阿托伐他汀具有抑制博莱霉素诱导大鼠肺成纤维细胞增殖的作用，并能抑制成纤维细胞分泌的MMP-9、TIMP-1。