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肝细胞肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在全球范围内其发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别排第六位和第二位。由于起病隐匿,早期没有症状或症状不明显,进展迅速,确诊时大多数病人已经达到晚期,发生了局部侵袭或远处转移,治疗困难,生存期短,预后差。近些年来关于肝细胞肝癌发病机制的研究越来越多,如细胞周期调控,表观遗传调控,端粒维持,基因突变等都在肝细胞肝癌发生和进展中发挥作用。已有研究发现肝细胞肝癌中存在P53蛋白的突变和TERT启动子突变。P53蛋白是在人类肿瘤的发生过程中起着重要作用的抑癌蛋白,P53蛋白的突变或失活与多种人类肿瘤的发生相关。P53蛋白最常见的突变是单一位点的错义突变,这种突变使正常的P53不能表达,失去了其原有的抑癌功能,表达突变型P53蛋白并获得促癌功能,因此这种突变又被称为功能获得性突变。在肝细胞肝癌中P53蛋白的功能获得性突变率高达32%。端粒酶逆转录酶TERT是端粒酶的催化活性的亚单位,其在多种肿瘤中都处于异常激活的状态,使细胞获得无限增殖的能力,因此被认为是肿瘤的重要标志物之一。TERT启动子区特异性突变则是肿瘤细胞中TERT异常激活的重要机制之一。研究发现肝细胞肝癌中端粒逆转录酶TERT启动子的突变率高达55%。GABPA是GA结合蛋白亚单位a,其作为一个转录激活因子,发挥着DNA结合的功能,并且它还参与了细胞色素氧化酶的活化和线粒体功能的细胞核调控机制。已证实在膀胱癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤中GABPA可以选择性结合于突变的TERT启动子产生的ETS结构域,从而激活TERT表达,促进肿瘤进展。在肝细胞肝癌中TERT启动子突变率高,但其具体的调控机制尚不清楚。GABPA是否也能以相同的方式激活并调控肝细胞肝癌中突变型TERT的表达,促进肝癌的发生发展,有待研究。肝细胞肝癌中P53蛋白的突变也很常见,那么突变的P53和GABPA,TERT之间是否存在相互调控关系,值得深入探讨。研究目的:研究人肝细胞肝癌细胞系中经典的抑癌蛋白P53的功能获得性突变是否可以通过GABPA介导或与GABPA共同调控端粒逆转录酶TERT的转录及其作用机制,为发现肝细胞肝癌中TERT调控的新机制,进而寻找新的分子靶标提供理论依据。研究方法:(1)检测肝癌细胞系TERT启动子的突变情况:分别提取四种肝癌细胞系HepG2、Huh-7、Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5的全基因组DNA,设计TERT启动子引物,进行PCR扩增,产物送公司进行测序,筛选出TERT启动子突变(C228T)的细胞系。(2)检测肝癌细胞系HepG2、Huh-7中P53蛋白的表达水平:分别提取HepG2、Huh-7细胞总蛋白,Western Blotting检测P53蛋白的表达水平,其中HepG2细胞为野生型P53蛋白,Huh-7细胞为Y220C突变型P53蛋白。(3)检测特异性siRNA下调或野生型/突变型高表达质粒上调P53表达对TERT表达的影响:分别在HepG2、Huh-7细胞中转染阴性对照或P53siRNA,72h后提取细胞总蛋白,Western Blotting检测P53蛋白水平,同时提取细胞RNA,qRT-PCR检测TERT mRNA水平。在HepG2细胞中分别转染野生型P53高表达质粒和R175H突变的P53高表达质粒,48h后提取细胞总蛋白,Western Blotting检测P53蛋白水平,并提取RNA,qRT-PCR检测TERTmRNA水平。(4)研究特异性siRNA下调GABPA表达对TERT表达的影响:分别在HepG2、Huh-7细胞中转染阴性对照或GABPA siRNA,72h后提取细胞总蛋白,Western Blotting检测GABPA蛋白水平,同时提取细胞RNA,qRT-PCR检测TERT mRNA水平。(5)免疫共沉淀试验检测P53蛋白与GABPA蛋白相互作用:提取HepG2、Huh-7细胞蛋白进行免疫共沉淀试验,检测P53蛋白与GABPA蛋白的结合情况。(6)荧光素酶活性试验检测P53对TERT启动子的调节作用:构建TERT启动子区域C228T位点突变型启动子报告质粒,在Huh-7细胞中分别转染P53 siRNA和GABPA siRNA,以及共转染P53 siRNA和GABPA siRNA,24h后再转染TK和突变型报告质粒,48h后收集细胞检测萤火虫荧光和海肾荧光。研究结果:(1)四种肝癌细胞系 HepG2、Huh-7、Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5 的 TERT启动子测序检测,结果显示HepG2、Huh-7中TERT启动子为C228T位点突变型启动子,而Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5中TERT启动子为野生型启动子。(2)肝癌细胞系HepG2中P53蛋白为野生型,而肝癌细胞系Huh-7中为Y220C位点突变型P53蛋白。HepG2中野生型P53和Huh-7中Y220C位点突变型P53蛋白在细胞内均有明显表达,并且突变型P53蛋白表达水平明显高于野生型P53蛋白。(3)在肝癌细胞系HepG2中抑制P53蛋白表达后TERT mRNA水平升高,高表达野生型P53后TERT mRNA水平降低,而高表达突变型P53后TERT mRNA水平却升高。在Huh-7中抑制突变型P53蛋白表达后TERT mRNA水平降低。(4)肝癌细胞系HepG2、Huh-7中抑制GABPA蛋白表达后TERT mRNA水平均降低。(5)在肝癌细胞系HepG2中野生型P53蛋白与GABPA蛋白未见明显结合,而在Huh-7细胞中突变型P53蛋白与GABPA蛋白存在明显结合。(6)在肝癌细胞系Huh-7中抑制突变型P53表达或抑制GABPA表达后,TERT启动子活性均有不同程度的降低,而同时抑制突变型P53和GABPA表达后,TERT启动子活性降低程度更为显著。研究结论:(1)在不同的肝癌细胞系P53的表型不同。HepG2中为野生型P53蛋白,Huh-7中为Y220C位点突变型P53蛋白,并且两种表型在各自的细胞中均有明显表达。(2)在不同的肝癌细胞系P53的表型影响其对TERT的转录调控。在肝癌细胞系中野生型P53负向调控TERT转录水平,突变型P53正向调控TERT转录水平。(3)在肝癌细胞系中GABPA正向调控TERT转录水平。(4)突变型P53蛋白对TERT的表达的转录调控是通过与GABPA蛋白相互结合,两者协同作用,共同结合于突变的TERT启动子而实现的。