转基因食品是利用现代分子生物技术,将生物某些基因转移到其他物种中,通过改造生物的遗产物质,使其在形状、营养物质、消费品质等方面为人们所需要。以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是“转基因食品”。转基因食品的主要有动物源性和植物源性两大类,其中植物源性的占到食品的大多数。本课题涉及到的转基因食品是指植物源性的食品。自1993第一个商品化的转基因延迟成熟西红柿在美国成功上市以来,转基因食品的主要原料——转基因作物的种植面积不断扩大,由1996年的170万公顷增长至2011年的1.6亿公顷,增长了94倍(超过美国或者中国的国土面积)。种植国家也由6个增至2011年的29个国家共同参与。其中发展中国家19个,发达国家10个,而全球超过一半的人口(约40亿人)居住在这29个国家。全世界大约有1670万农民种植转基因作物,直接创造经济价值达15亿美元。另外全球共约60个国家批注使用(种植或进口)30多种转基因作物为食品原料。这些数据均表明转基因作物已成规模并悄然进入我们的生活,转基因食品并不遥不可及。转基因食品作为新新食品,其安全性存在许多不确定因素。因此,各国为对其监测与监管纷纷制定了相应的法律法规,并制定了一系列检测判断转基因食品的标准。检测转基因食品的方法有很多,主要分为蛋白质水平的检测与分子水平的检测两大类。但转基因食品,经过多道程序加工处理,绝大部分蛋白质已经被变性、破坏,检出率较低。所以分子水平的检测更为普遍。常见的分子水平的检测方法有：(1)PCR技术：又分为普通定性PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等；(2)基因芯片技术；(3)其它新型技术：如：随机扩增多态性DNA技术(Random amplified polymorphic DNA,RAPD技术)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP技术)、简单重复序列又称微卫星DNA技术(Simple Sequence Repeat, SSR技术),和简单序列重复区间扩增多态性分子标记(Inter-Simple Sequence Repeats, ISSR)等。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由Notomi等所属的日本荣研株式会社于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该技术的基本原理是针对待测基因靶序列的6个特异性区域设计两对引物(分别称为上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3),利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)保温30-60分钟,即可实现核酸的大量扩增。其特点是操作简单、快速、特异性高、成本低廉,故被广大研究者认为是可能替代PCR的新的核酸扩增技术。本研究采用LAMP检测技术,针对转基因大豆GTS40-3-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT176和转基因水稻TT51-1四个品系的外源插入基因、内源参照基因、品系特异性基因进行相关实验研究。研究内容主要分为三个部分：第一部分：查找相关文献资料,以转基因大豆GTS40-3-2的外源插入基因CP4EPSPS为研究对象,摸索LAMP检测技术反应体系与相关参数。通过一系列实验,得出结论为：在25gL反应体系中,1mmol/L甜菜碱,2.0mmol/LMg20.8μL(即8U)Bst DNA聚合酶、0.8mmol/LdNTPs、内外引物浓度比为1/8加入去离子灭菌水补足体系,65℃恒温度60min,LAMP反应体系比较稳定,扩增产物条带清晰。第二部分：针对转基因大豆GTS40-3-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT176和转基因水稻TT51-1四个品系的相关待检测基因设计合成引物。分别从这四个品系阳性标准品中提取基因组DNA作为模板,以F3,B3为引物,通过PCR扩增获得目的基因片段。通过T4连接酶连接将其插入pMD-18T连接载体中。通过质粒PCR鉴定出阳性重组质粒,DNA测序鉴定其序列的保真性。实验结果表明,成功克隆相应基因,并将其正确地插入到pMD-18T连接载体克隆位点中,获得含有相应基因的标准质粒分子。第三部分：将构建好的阳性标准质粒分子按照倍比稀释的方式,依次配制成2000000copies/μl,200000copies/μl,20000copies/μl,2000copies/μl,200copies/μl,20copies/μl,2copies/μl七个梯度的标准溶液进行LAMP检测。判断该检测方法对各个基因的灵敏性及最低检测阈值。用限制性内切酶酶切的方法判断该检测技术的准确性。用同一引物扩增不同产物的方法判断该检测方法的特异性。并用荧光性PCR或SYBR Green Ⅰ直接染色法对该检测方法的实验结果进行验证。最后利用LAMP检测方法对市售加工类食品的检测。结果表明：LAMP检测各基因,除转基因水稻TT51-1品系特异性序列的最低检出域值为：200copies/μl外,其余各基因检出的最低阈值均小于200copies/μl。限制性内切酶酶切分析显示酶切后的片段大小和理论片段大小基本一致。荧光定性PCR或SYBR Green Ⅰ直接染色法的实验结果也与其相一致。一系列实验证明LAMP检测方法的可行性、准确性、重复性、灵敏性、特异性均比较良好,可以用于转基因食品的检测。结论：本课题通过查阅转基因相关文献、进出口检验检疫局航标及国家标准确定待检测物种的品系名称及待检测基因。利用Primer Explorer4.0、primer premier6.0等专业引物设计软件设计待测基因目的片段的扩增引物。一系列实验确定LAMP反应的最佳条件及最佳反应体系。构建标准质粒分子确定LAMP检测方法检测各个基因的灵敏性,限制性内切酶酶切、荧光定性PCR、SYBR Green Ⅰ直接染色法等方法验证该技术的准确性和重复性。最后通过上述实验验证后,应用于实际加工食品检测。本研究初步验证了LAMP检测方法对转基因食品检测的可行性。其操作简单、快速、特异性高、成本低廉等特点吸引着研究者在更多转基因物种及其品系上的进一步尝试与研究。而这一切都为将来进一步研究LAMP检测方法的应用奠定了基础。