离子束辅助农杆菌介导抗赤霉病基因tri101转化小麦成熟胚的初步研究

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小麦是我国的主要粮食作物,它不仅是人类的重要食物来源,还是畜牧业中饲料的重要来源,另外它还是许多轻工业产品的重要原料。然而赤霉病等小麦病害严重影响小麦的产量和品质,给农业生产和人民生活带来巨大的损害。赤霉病产生的DON毒索还危及人类食品和动物饲料的安全,对人类和动物的身体健康造成危害。tri101基因是降解赤霉病菌毒素的一个主要结构基因,它在植物中的表达不仅可以降低赤霉病的发病率,还能减少真菌毒素的积累,从而降低赤霉病对小麦产量和品质的影响。通过基因工程的方法,使tri101基因在小麦中高效表达,可以提高小麦抗病功能,减轻赤霉病毒素对小麦生长的危害,有望增加小麦的产量和质量,创育出超高产的小麦品种。本研究将降解赤霉病菌毒素基因tril01基因与pCAMBIA1304载体融合,构建了小麦转化载体pCAMBIA1304-tri101并转化小麦,以期该基因在小麦里特异表达,从而提高小麦抗病功能,减轻赤霉病毒素对小麦生长的危害。同时,我们选择一个比较新的植物转基因方法--离子束介导法,并探讨了真空处理和离子剂量这两个重要因素对小麦出苗率和种子活力的影响,以期探索一种更完善、快捷的转基因方法,为植物遗传转化和新品种改良提供帮助。现将本研究的主要结果报道如下:   1.小麦转化表达载体的构建   将降解赤霉病菌毒素基因tri101基因与pCAMBIA1304载体融合,构建了小麦转化表达载体pCAMBIA1304-tri101。采用冻融法将构建好的植物表达载体成功转入农杆菌菌株LBA4404。   2.不同离子注入参数对小麦出苗的影响研究   探讨了真空处理和离子剂量这两个重要因素对小麦出苗率和种子活力的影响,发现真空处理对小麦出苗率和种子活力影响均不大,离子剂量对出苗率的影响明显,低剂量的处理对种子出苗率影响较小,随着剂量增加,出苗率程直线下降。通过比较,得到适合进行小麦基因转化的最佳参数:真空度10-3~10-2pa、能量30kev、束流200mA、脉宽400μs、频率25Hz、剂量为8×1017N+/cm2,真空处理时间2~3h。   3.离子束介导tri101基因转化小麦   使用离子束对小麦胚部进行照射处理,然后通过农杆菌侵染将外源基因tri101整合到小麦细胞中。对侵染后的小麦进行土培法和组培法两个处理,经Gus组织化学染色和PCR检测,在20000粒进行土培法处理的种子中得到22株部分叶片或根部转化成功的植株,转化率为0.11%;在5000粒进行组培法处理的种子中得到2株转化成功的植株,转化率为0.04%。证明利用离子束辅助农杆菌介导法转移外源基因是可行的,但是在转化过程中仍有一些问题需要解决。
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