鸭疫里氏杆菌Riemerella anatipestifer(RA)病,又名鸭传染性浆膜炎。该病是雏鸭、雏火鸡和其他多种禽类的一直常见的急性败血性传染病,主要表现为纤维素心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎和脑膜炎等。该病死亡率高、淘汰率高,对鸭危害极大。近年来,耐药性问题,日益严重。单克隆抗体具有高度特异性,无耐药性和药物残留等问题。本试验利用全菌免疫法制备单克隆抗体,以动物试验来评价其效果,为鸭疫里氏杆菌病的防治提供技术支持。试验内容,从以下方面展开。1 细菌的分离与鉴定本研究从病料上分离病原,进行鉴别培养;染色镜检;以通用引物作PCR扩增,并将扩增产物进行测序与BLAST比对,构建系统发育树;同时进行药敏试验和生化特性鉴定;以玻片凝集试验鉴定细菌血清型;以细菌纯培物攻毒雏鸭,进行回归致病试验。结果表明:分离菌为鸭疫里氏杆菌菌株;不发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖、甘露醇,硫化氢、明胶穿刺结果均为阴性,MR实验、VP分离实验均为阴性,可分解过氧化氢;细菌对链霉素高度敏感,对阿米卡星中度敏感,对阿莫西林、氨苄西林、卡那霉素、复方新诺明、环丙沙星、庆大霉素、多粘菌素、四环素均为低度敏感;细菌血清型鉴定为RAⅡ型;细菌可以复制典型浆膜炎病例。2 抗RA单克隆抗体的制备以分离菌作为免疫原,与弗氏佐剂混合乳化,制成疫苗,每隔2周免疫一次,4次免疫SPF级BALB/c小鼠,最后一次免疫不加佐剂,取同样剂量抗原腹腔注射小鼠。三天后,若小鼠血清效价高于1:6400,取脾细胞与活力良好的骨髓瘤细胞进行细胞融合,克隆、与亚克隆。对得到阳性细胞进行冻存稳定性试验、分泌稳定性试验、细胞核型分析、以大肠杆菌沙门氏菌作为参考菌株作特异性鉴定、以试剂盒鉴定单克隆抗体亚类、作Western bloting。结果显示,最后获得3株阳性的杂交瘤细胞株,分别为3A8、3D11、4D1,细胞冻存前后生长良好,细胞上清OD值变化不大;经间接ELISA鉴定,单抗3D11的亚型为Ig G3,单抗3A8、4D1的亚型为Ig M;这三种单抗具有良好的特异性,不与大肠杆菌、沙门氏菌交叉反应。Western-blot结果显示单抗3A8、4D1可以与55KD左右的蛋白条带结合,而3D11反应性不好。3 抗RA单克隆抗体的保护试验将18只10日龄雏鸭分为三组,每组6只。一组注射0.1m L浓度为2×10~9CFu/m L的RA菌液攻毒人工发病,同时注射0.1m L生理盐水,作为攻毒组;一组注射0.1m L浓度为2×10~9CFu/m L的RA菌液攻毒人工发病,同时注射0.1m L纯化后的4D1单克隆抗体,作为保护组;一组注射0.2m L生理盐水,作为空白对照组。试验观察7天,7天后扑杀。结果攻毒组鸭的死亡数目比保护组的多,死亡速度快,空白组无明显变化。剖检变化显示,保护组组织器官受损轻微,攻毒组损伤明显。攻毒组与保护组病理变化相似,均表现为组织水肿、充血,心肌细胞蜡样坏死,肝细胞结构紊乱,发生空泡样变,脑细胞的坏死。说明单克隆抗体具有延迟发病,缓解症状,降低死亡率的作用。试验分离一株RAⅡ型,属于我国流行的主要血清型,细菌高度耐药,与现状相符。试验结果证明单克隆抗体具有一定保护作用,具有实际价值。试验为鸭疫里氏杆菌病的单抗防治方法,提出了理论依据。