牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD),也称粘膜病,是一种在世界范围内广泛流行的牛感染性疾病,对全世界许多国家的畜牧业和乳制品行业均造成了巨大的财产损失。牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的,可引起牛的多种临床症状,主要包括呼吸道疾病、腹泻、高热、免疫系统疾病、生殖障碍、持续性感染和粘膜病等。BVDV是单股正链RNA病毒,自身被囊膜包被。成熟的BVDV病毒形状呈球状,直径为40-60 nm,囊膜表面有环形亚单位,大小约为10-12 nm,核衣壳是由20面体对称的、分子量为14 Ku的衣壳蛋白构成。它属于黄病毒科(Flaviviridae)中的瘟病毒属(Pestivirus),是黄病毒科瘟病毒属的代表。BVDV基因组全长约为12.5 Kb,含有一个大的开放阅读框,可以被翻译成多个蛋白,包括病毒的4种结构蛋白和8种非结构蛋白。4种结构蛋白来源于多蛋白的N-末端:包括核衣壳蛋白C和表面糖蛋白Erna,E1和E2。8种非结构蛋白包括:Npro,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B。BVDV E2是BVDV病毒粒子免疫原性的主要决定因子,其本身也成为针对BVDV新型疫苗研制的重要潜在靶标。BVDV E2特异性的单克隆抗体在临床上已经显示出对BVDV-1和BVDV-2两种类型明显的病毒中和能力。这些结论都对针对BVDV E2新型疫苗的研制提供了强有力的支撑。因此,BVDV E2蛋白是新型疫苗的主要研究对象。干酪乳杆菌作为一种益生菌,可以定植在牛肠道内。本身作为佐剂和载体发挥双重作用,它能够使细胞和全身免疫系统中抵抗外源抗原能力显著增强,因此它们作为疫苗载体更具吸引力。目前,干酪乳杆菌被认为是比沙门氏菌和李斯特菌等更有效的活疫苗载体。由于能够增强宿主的免疫反应,通过重组,干酪乳杆菌的内在佐剂和细胞因子可以诱导特异性表达反应性抗原的产生,因此,干酪乳杆菌作为异源表达分子受到更多的重视和运用。干酪乳杆菌作为载体被证明可以显著提高动物存活率,控制动物体重减轻,减少肝脏和大肠的损伤,与传统灭活疫苗相比有更好的保护效力。本研究首先构建含有UPP上游同源臂(UPP-u)-slpA-BVDV E2-GFP-pgsA-rrnBT1T2-UPP下游同源臂(UPP-d)融合蛋白表达盒的干酪乳杆菌UPP敲除质粒,构建完成经基因型鉴定,其序列与NCBI库中各基因一致性达到99%。其次,将UPP敲除质粒在电转化的条件下导入干酪乳杆菌中,通过基因重组将干酪乳杆菌UPP基因敲除,经过后期PCR鉴定和Western Blot鉴定,我们获得一株能够表达BVDV E2蛋白的干酪乳杆菌重组菌株。最后,我们在个体水平上对重组干酪乳杆菌保护效力做了检测,在初次免疫后第23天对各组小鼠攻毒,根据结果我们发现,重组干酪乳杆菌免疫组较原始干酪乳杆菌对照组有更好的保护力,一定程度上证实了重组菌落成功的可能性。总之,本研究利用基因重组的手段构建出一株表达BVDV E2蛋白的干酪乳杆菌重组菌株,并证明其本身的保护作用,是BVDV疫苗研究领域的一个全新的探索,为BVDV活载体疫苗研制提供了一种新的思路。