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目的：构建hIL-10基因酵母表达载体，表达有生物活性的hIL-10并探索合适的表达条件，为进一步研究IL-10生物学功能和生物制品开发及临床应用打下基础。
方法：1、设计和合成引物，通过PCR从质粒pORF-hIL-10中扩增hIL-10基因。2、表达载体构建及鉴定：以EcoRI/XbaI对hIL-10基因进行酶切，酶切产物连接至经过同样酶切的质粒pPICZαA；纯化重组质粒并电转化E.coli DH5α，用含Zeocin的LB培养基筛选重组大肠杆菌并作菌落PCR鉴定，抽提质粒进行酶切和DNA测序鉴定。3、重组质粒转化毕赤酵母及重组酵母菌株的筛选鉴定：以SacI对重组质粒pPICZαA-hIL-10作线性化处理，通过电击将线性化质粒导入毕赤酵母X-33中，用不同Zeocin浓度的YPDS平板筛选重组酵母菌株并作菌落PCR鉴定，用MD和MM平板筛选：His+Mut+表型的重组酵母菌株。4、rhIL-10表达和鉴定：以0.5％甲醇诱导重组酵母表达rhIL-10，并通过SDS-PAGE和Western Blot法分析鉴定rhIL-10，用ELISA法定量测定上清中的rhIL-10含量，用Bradford法测定上清中总蛋白含量，计算rhIL-10在总蛋白中所占比例。5、发酵条件优化：以SDS-PAGE分析不同温度、不同pH值和有无蛋白酶抑制剂条件下上清液中rhIL-10的表达量，探索毕赤酵母表达rhIL-10的适宜发酵条件。6、rhIL-10对细胞增殖的影响：以人外周血淋巴细胞转化试验和MCF-7细胞增殖试验分析rhIL-10的生物学活性。
结果：1、表达载体构建：经PCR从质粒pORF5-hIL-10中扩增获得了hIL-10基因；通过菌落PCR，手重组质粒转化E.coli DH5α形成的重组菌中扩增获得hIL-10基因；重组质粒经EcoRI/XbaI酶切后获得约540bp的小片段和3500bp的大片段；DNA测序结果与Genbank中报道的hIL-10基因序列一致。重组质粒转化毕赤酵母X-33后，以菌落PCR法于重组酵母中扩增获得hIL-10基因。2、hIL-10的表达：重组质粒转化宿主酵母X-33获得了HiS+Mut+表型的重组酵母菌株。以甲醇诱导重组酵母表达后，经SDS-PAGE分析，24h后各时段的上清，在相对分子量40kD左右可见目的蛋白条带，36h上清目的蛋白表达量最高，表达时间可持续数天；Western Blot可见对应位置有特异性蛋白质条带；ELISA法测得rhIL-10在摇瓶培养36h的浓度为20mg/L，Bradford法测得培养上清中总蛋白质含量为50 mg/L，rhIL-10占总蛋白比例为40％。pH值改变时，rhIL-10的表达量有所变化，pH值为6.0时表达量最高；温度不同时rhIL-10的表达量也有差别，27℃时的表达量最高；加入抑制剂时rhIL-10的表达量高于不加抑制剂时。3、rhIL-10对细胞增殖的影响：在外周血淋巴细胞转化试验中，不同浓度rhIL-10对淋巴细胞增殖指数的影响不同，含rhIL-10上清10-1稀释组和10-2稀释组均抑制了淋巴细胞的增殖，上清10-3稀释组没有明显抑制了淋巴细胞的增殖。在MCF-7细胞增殖试验中，所做各浓度上清与hIL-10标准蛋白均促进了MCF-7细胞增殖。上清在实验的浓度范围内，促进MCF-7细胞增殖的程度没有明显差别。
结论：成功构建了hIL-10基因酵母表达载体pPICZαA-IL-10；重组质粒电转化X-33只形成Mut+表型转化子，获得了较高水平的分泌表达的酵母工程菌；表达产物rhIL-10具有良好的生物学活性；同时发现发酵条件对rhIL-10的表达水平影响较大，改善发酵条件能提高rhIL-10的表达量。