冠状病毒能够感染人类和多种动物,主要引发人类和不同种类动物的呼吸系统和肠道疾病。其中SARS-CoV和MERS-CoV都曾引发人类社会的强烈关注,给人类健康带来巨大威胁。犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)与上述两种极具威胁的冠状病毒共同被划分在冠状病毒亚科Beta属之中,是引发犬类传染性呼吸道疾病(CIRD)的主要病原体之一,给犬饲养者带来不小的经济损失。当冠状病毒附着并侵入宿主细胞后,病毒劫持宿主的核糖体并用于翻译其自身的复制酶多蛋白链(pp1ab、pp1ab)。由于在切割复制酶多蛋白链的过程中,主蛋白酶(nsp5)负责切割复制酶多蛋白链的11保守的切割位点,因此主蛋白酶在冠状病毒的复制过程中起到了关键作用,也是病毒组装自身复制转录复合物(RTC)的前提。针对此靶点,我国研究团队曾基于已解析的SARS-CoV主蛋白酶原子分辨率的三维结构,分析和研究SARS-CoV主蛋白酶的关键氨基酸的位置和功能,进而设计、合成出一种利用亲核进攻主蛋白酶半胱氨酸进行迈克尔加成反应的先导化合物N3。本论文中我们将犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)主蛋白酶作为研究对象,完成了犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)主蛋白酶的克隆、表达和纯化、结晶筛选和晶体优化、晶体衍射、数据收集和结构初步解析以及相关酶学实验。论文详细阐述和重点分析了:1、分子克隆构建载体表达真实N端和C端CRCoV主蛋白酶的分子设计、蛋白质表达和纯化过程,讨论了还原剂对蛋白质的影响;2、结晶实验、数据收集以及结构初步解析;3、测定CRCoV主蛋白酶活性、抑制剂N3抑制效果。本论文为深入理解冠状病毒家族的主蛋白酶的结构和功能提供了新的信息,也为进一步基于结构进行后续的药物开发提供了重要依据。