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大量研究证明,哺乳动物的细胞间通讯在胚胎着床前已经建立。间隙连接通道是相邻细胞之间唯一可以直接进行信息交流的细胞通讯途径。间隙连接蛋白基因(connexins)作为组成间隙连接通道的基本单位,在哺乳动物早期胚胎发育过程中广泛存在。由于connexins的多样性和时空表达的特异性,到目前为止关于相关特定基因在胚胎发育早期过程中的功能知之甚少。本研究主要采用RT-PCR、Real-time PCR、免疫组织化学和Westernblot等分子生物学技术,结合体外受精技术,检测connexins在绵羊卵母细胞和体外受精早期胚胎中表达的多样性以及connexin43和connexin45的表达规律；同时通过在胚胎单个卵裂球内注入小分子染料,观察间隙连接通讯在绵羊体外受精早期胚胎中的形成时间；并采用RNAi技术,对绵羊体外受精卵进行dsRNA注射,观察connexin43和connexin45在绵羊体外受精胚胎发育过程中的作用。一、RT-PCR方法检测多种间隙连接蛋白在绵羊体外受精胚胎中的表达从NCBI中获取六种间隙连接蛋白基因的cDNA序列并合成引物,用RT-PCR方法获得目的基因的部分cDNA序列,然后进行测序并通过序列比对以确定所获得的cDNA序列的正确性。在此基础上收集绵羊未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞、2-细胞、8-细胞、桑椹胚以及囊胚,通过RT-PCR方法检测connexin26、connexin31、connexin32、connexin40、connexin43和connexin45等基因在绵羊未成熟卵母细胞、体外成熟卵母细胞、体外受精2-细胞、8-细胞、桑椹胚以及囊胚中的mRNA表达水平。结果发现,connexin26、connexin32、connexin43及connexin45在绵羊卵母细胞和早期胚胎发育的各个时期均有表达；但未检测到connexin31和connexin40转录子。二、Connexin 43 (Cx43)和connexin45 (Cx45)在绵羊卵母细胞和体外受精早期胚胎中转录子表达规律以及蛋白水平的检测1、Real-time PCR方法检测Cx43、Cx45在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达对Cx43和Cx45在绵羊未成熟卵母细胞、体外成熟卵母细胞、体外受精2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚期胚胎分别进行Real-time PCR检测,结果显示：Cx43在未成熟卵母细胞、体外成熟卵母细胞、2-细胞中表达量较低,分别是8-细胞含量的0.11、0.3、0.44倍；到达桑椹胚和囊胚期时达到最高,为8-细胞含量的2.44和2.32倍；而Cx45在8-细胞时表达量最高,未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞和2-细胞期的表达量分别为8-细胞期的0.43、0.72和0.82倍,桑椹胚和囊胚期胚胎的表达量分别为8-细胞期的0.93和0.89倍。2、免疫组化方法检测Cx43、Cx45在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达对Cx43和Cx45在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达进行免疫组化检测,结果发现：在绵羊未成熟卵母细胞、体外成熟的卵母细胞、体外受精的2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚等各个发育时期的胚胎中,Cx43、Cx45蛋白均有表达,并主要分布在细胞膜区域,在细胞质中分布很少,而在细胞核中未检测到。在对照组体内受精的胚胎中,Cx43和Cx45从2-细胞期到早期囊胚均有表达,两者表达部位均靠近细胞膜区域。体内受精胚胎和体外受精胚胎的表达模式基本一致,而Cx43和Cx45蛋白在体内受精胚胎中的表达量相对高一些。体内受精胚胎中转录子的含量往往高于体外受精胚胎,这是否是导致体内外受精胚胎在质量上有所不同的原因之一,尚有待进一步研究。3、蛋白印迹检测Cx43在绵羊卵母细胞和体外受精胚胎中的表达对绵羊未成熟和体外培养成熟的卵母细胞分别进行蛋白印迹检测结果发现,在未成熟和体外成熟的卵母细胞中Cx43蛋白均有表达,且蛋白电泳表现出两种磷酸化形式(P1和P2)和一种非磷酸化形式(P0)。Cx43在体外成熟卵母细胞中的蛋白表达量要高于未成熟卵母细胞。而在早期胚胎中检测结果,Cx43在2-细胞期、8-细胞期、桑椹胚期和囊胚期胚胎中均得到阳性条带,与免疫荧光染色结果完全一致。免疫印迹在膜上显示出三条带,与Cx43常规表达模式相同。胚胎在2-细胞期和8-细胞期时Cx43蛋白的磷酸化形式表达量略高于非磷酸化形式,到达桑椹胚期时非磷酸化形式含量有所增加。三、绵羊体外受精早期胚胎中间隙连接通讯的检测本实验通过显微注射技术与激光扫描共聚焦观察方法,将小分子荧光染料Lucifer yellow注射到发育到不同时期胚胎的单个卵裂球中,观察荧光染料向其它相邻卵裂球扩散情况。结果发现,注射到2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞及桑椹胚期胚胎卵裂球中的染料没有向相邻卵裂球扩散。可以推测,绵羊体外受精早期胚胎在发育早期并未建立间隙连接通讯。四、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA对绵羊体外受精胚胎发育的影响1、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA对目的基因mRNA和蛋白水平的影响将Cx43 dsRNA、Cx45 dsRNA和水分别注入绵羊体外受精卵,与未注射的空白对照组一起继续培养。通过Real-time PCR方法观察到,与对照组相比,当胚胎发育到囊胚期时Cx43mRNA和Cx45mRNA含量分别下降了74%和44%；而注水组的Cx43和Cx45 mRNA含量与未注射的对照组基本一致。同时检测到作为对照的β-actin基因、E-cadherin基因和Catenin基因的mRNA水平则在各组中基本保持一致,表明体外合成的dsRNA并未对其它对照基因mRNA的表达产生影响,能够特异而有效的降低目的基因的mRNA水平。对囊胚期胚胎进行蛋白印迹实验表明,与未注射对照组相比,向体外受精卵中注射Cx43的dsRNA能够使得Cx43dsRNA注射组中的Cx43蛋白含量下降。免疫组织化学方法结果显示,与未注射对照组相比,注射Cx43 dsRNA和Cx45 dsRNA后一定时间后,目的基因的蛋白表达均有不同程度的下降,并能够维持到囊胚期。因此,向绵羊体外受精卵中注射Cx43和Cx45 dsRNA能够使目的基因的mRNA及蛋白含量下降并持续到囊胚期。2、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA对绵羊体外受精胚胎卵裂率的影响。Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA注射48小时后胚胎发育情况是：在Cx43 dsRNA处理试验中dsRNA注射组、水注射组和未注射组的总卵裂率分别为83.7%、84.5%和81.5%；其中2-细胞期胚分别为5.6%、4.7%和4.6%,4-细胞期胚分别是14.6%、10.8%和10.3%,8-细胞期胚分别是64.5%、68.9和66.6%；在Cx45处理实验中dsRNA注射组、水注射组和未注射组的总卵裂率分别为81.7%、76.9%和77.5%;其中2-细胞期胚分别为7.6%、3.6%和3.8%；4-细胞期胚分别是13.9%、11.6%和7.2%；8-细胞期胚分别是60.3%、61.8%、66.5%。通过统计学方法分析以上结果可以看出,dsRNA处理组与水注射组和未注射组之间总卵裂率及8-细胞期发育率无显著差异(P＞0.05),表明对Cx43或Cx45基因进行RNA干涉并不影响绵羊体外受精卵的早期发育。3、Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA的注射对绵羊体外受精胚胎囊胚发育率的影响。Cx43dsRNA、Cx45 dsRNA注射后体外受精卵的囊胚发育情况是：在Cx43处理实验中dsRNA注射组、水注射组和未注射组的囊胚发育率分别为20.3%、21.7%和34.5%,囊胚孵化率分别是19.2%、37.5%、41.3%,囊胚细胞数分别为76、74、83,囊胚细胞死亡数和死亡率分别为18.7(24.6%)、11.7(15.4%)、15.1(18.2%)；在Cx45处理实验组dsRNA注射组、水注射组和未注射组的囊胚发育率分别为20.8%、19.4%和32.5%,囊胚孵化率分别是18.5%、25.0%和34.9%；囊胚细胞数分别为79、71和72；囊胚细胞死亡数和死亡率分别为16.7(21.1%)、12.7(17.9%)、11.3(15.7%)。通过统计学分析可以看出Cx43 dsRNA处理组的囊胚发育率和囊胚细胞数与未处理组相比差异不显著(P＞0.05)；而囊胚孵化率显著高于未处理组(P＜0.01),且囊胚细胞死亡率也略高于未处理组。Cx45 dsRNA处理组的囊胚发育率、囊胚细胞数、囊胚孵化率与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。表明Cx43 dsRNA处理并不能影响绵羊体外受精胚的囊胚发育率,但可能对囊胚质量有一定的影响；Cx45 dsRNA处理并不影响绵羊体外受精胚的囊胚发育率及囊胚质量。