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特发性基底节钙化(Idiopathic basal ganglia calcification，IBGC)是一种以脑组织双侧发生渐进性钙质沉积为主要病理特征的遗传性神经系统疾病，临床症状包括肌张力障碍、共济失调、帕金森病样症状、痴呆、情感障碍、精神错乱、记忆力下降、偏头痛和癫痫等。本课题组在2012年首次克隆第一个IBGC的致病基因SLC20A2，该基因编码III型钠磷转运蛋白2（PiT2），它主要将细胞外的无机磷（Pi）转运到细胞内，在维持细胞磷稳态中起重要作用。SLC20A2突变使PiT2丧失Pi转运功能，导致胞外Pi积累可能引发IBGC。现有研究表明SLC20A2是IBGC的主要致病基因，在IBGC患者中的突变检出率为40-50%。然而，有关SLC20A2突变导致IBGC的发病具体机制不清楚，且至今对IBGC没有任何有效的预防与治疗策略。
为了更好地探索IBGC的发病机制，开发有效预防与治疗IBGC的药物，建立一个合适的IBGC疾病动物模型是十分必要的。小鼠与人的PiT2蛋白同源性高达91%，在神经系统中的表达模式也与人类似。因此，本研究利用同源重组技术构建具有Slc20a2p.S602W点突变的knock-in（Slc20a2-KI）小鼠，该突变位点与IBGC患者携带SLC20A2p.S601W突变位点一致。选择10月龄野生型（WT）、Slc20a2-KI杂合（Slc20a2+/S602W）和Slc20a2-KI纯合（Slc20a2S602W/S602W）小鼠进行脑组织病理切片染色，发现Slc20a2-KI纯合小鼠脑部有严重钙化，而WT和Slc20a2-KI杂合小鼠没有钙化。分别检测年龄依次为2、2.5、3、4、6和8个月的Slc20a2-KI纯合小鼠颅内钙化情况，发现3月龄小鼠丘脑部位开始有较小钙化结节出现；4月龄小鼠脑中钙化比较明显，主要集中在丘脑；6月龄后小鼠脑部钙化非常明显，且主要分布于丘脑、纹状体、下丘脑、中脑、皮质和海马，丘脑钙化最为严重。以上结果证实IBGC颅内钙化的发生发展是动态的，可随时间的进展而加重。为了观察IBGC小鼠颅内钙化的精细结构，本研究选取6月龄Slc20a2-KI纯合小鼠脑组织进行亚显微结构观察，发现钙化结节大小不一、形状不规则，内部电子密度高低不等呈同心圆板层排列。
在IBGC患者中发现随着年龄增加，严重的颅内钙化引起许多锥体外系的临床表型，本研究建立的Slc20a2-KI纯合小鼠是否有异常行为？选取14月龄小鼠进行行为学检测，与WT小鼠相比，Slc20a2-KI纯合小鼠呈现出平衡与运动能力变差、焦虑情绪减少以及学习与记忆能力降低等表型。以上结果表明，Slc20a2-KI纯合小鼠模拟了IBGC患者临床表型，是一个很好的IBGC疾病模型。此外，与IBGC患者类似，Slc20a2-KI纯合小鼠的生殖、生长发育等情况正常，这不仅有利于小鼠快速繁殖，加快实验进程，而且在药物研究中，便于观察药物对小鼠身体的副作用影响。
本课题组早期体外实验发现SLC20A2突变造成PiT2的Pi转运障碍，推测在脑中可能会导致胞外Pi累积，造成局部Pi浓度升高，进而引发脑部钙化。为了在体内验证，本研究分别提取2月龄WT、Slc20a2-KI杂合和Slc20a2-KI纯合小鼠的脑脊液（CSF）和血清，通过钼酸盐-孔雀石绿分光光度法测定Pi浓度，Slc20a2-KI纯合小鼠CSF的Pi浓度（平均值=1.858mM）与WT小鼠（平均值=1.149mM）相比显著升高，而Slc20a2-KI杂合小鼠CSF的Pi浓度（平均值=1.163mM）与WT小鼠无显著差异，此外3种基因型小鼠血清Pi浓度（WT平均值=3.961mM，Slc20a2-KI杂合平均值=3.996mM，Slc20a2-KI纯合平均值=3.857mM）无显著差异。以上结果说明，PiT2对于维持CSF中Pi稳态发挥重要作用，而CSF中Pi浓度的升高很可能是导致脑部钙化形成的病理生理基础。
为了进一步揭示SLC20A2突变导致颅内钙化发生的分子机制，应用蛋白质组学技术对WT、Slc20a2-KI纯合和Slc20a2敲除（Slc20a2-KO）纯合小鼠脑组织的差异表达蛋白进行分析，与WT小鼠相比，Slc20a2-KI纯合和Slc20a2-KO纯合小鼠脑中的骨调素、骨钙素和胶原蛋白IV表达量都升高；通过实时定量PCR实验进一步验证它们的mRNA水平也显著增高。免疫组织化学染色发现，骨调素和胶原蛋白IV与颅内钙化结节明显共定位，二者可能是颅内钙化的部分有机成分；检测CSF中骨调素，发现与WT小鼠相比，Slc20a2-KI纯合小鼠在3月龄时CSF中骨调素的浓度显著增高，可能是颅内钙化的标志性蛋白。进一步对Slc20a2-KI纯合小鼠组织学观察，发现大量初始形成的微小钙化结节与血管直接相连，在钙化周围存在大量细胞外囊泡。检测与血管钙化相关的蛋白发现，碱性磷酸酶和骨保护素与颅内钙化结节也具有明显的共定位。
本研究选择依替膦酸二钠，对Slc20a2-KI纯合小鼠进行长期口服给药，分别比较4、5、6和7月龄的正常组和依替膦酸二钠组的Slc20a2-KI纯合小鼠，发现两组小鼠颅内的钙化程度都没有明显差异，表明依替膦酸二钠对小鼠颅内钙化没有抑制作用。同时，通过对Slc20a2-KO纯合小鼠进行为期1个月的低磷饮食，发现2月龄Slc20a2-KO纯合小鼠（还未出现颅内钙化），低磷饮食可以将CSF中异常增高的Pi浓度降低至正常水平，并且有效抑制其颅内钙化的发生；对于3月龄Slc20a2-KO纯合小鼠（已出现颅内钙化），低磷饮食可以部分降低CSF中异常增高的Pi浓度，对颅内钙化的累积速度具有一定的延缓作用。但低磷饮食也引起小鼠血清Pi浓度下降，长期低磷饮食会导致低磷血症。因此，低磷饮食对IBGC患者有一定的副作用，但可以有效抑制或延缓颅内钙化形成，这对IBGC发病机制的理解及对其预防与治疗研究的探索具有很大帮助。
总之，本研究成功构建了一个对人类IBGC疾病模拟程度非常高的Slc20a2-KI纯合小鼠模型，证实颅内钙化的发生的确与脑内Pi稳态失衡有关；首次揭示了骨调素、胶原蛋白IV、碱性磷酸酶和骨保护素与颅内钙化的形成有关，是颅内钙化的部分有机组成成分，并且CSF中的骨调素浓度异常升高，可能是颅内钙化的标志性蛋白；确定了PPi的类似物依替膦酸二钠对Slc20a2-KI纯合小鼠颅内钙化没有抑制效果；而低磷饮食，可以通过改善小鼠脑内Pi稳态，有效抑制Slc20a2-KO纯合小鼠颅内钙化的发生和累积速度。上述研究促进了人们对IBGC致病机理的理解，为IBGC防治奠定基础。
为了更好地探索IBGC的发病机制，开发有效预防与治疗IBGC的药物，建立一个合适的IBGC疾病动物模型是十分必要的。小鼠与人的PiT2蛋白同源性高达91%，在神经系统中的表达模式也与人类似。因此，本研究利用同源重组技术构建具有Slc20a2p.S602W点突变的knock-in（Slc20a2-KI）小鼠，该突变位点与IBGC患者携带SLC20A2p.S601W突变位点一致。选择10月龄野生型（WT）、Slc20a2-KI杂合（Slc20a2+/S602W）和Slc20a2-KI纯合（Slc20a2S602W/S602W）小鼠进行脑组织病理切片染色，发现Slc20a2-KI纯合小鼠脑部有严重钙化，而WT和Slc20a2-KI杂合小鼠没有钙化。分别检测年龄依次为2、2.5、3、4、6和8个月的Slc20a2-KI纯合小鼠颅内钙化情况，发现3月龄小鼠丘脑部位开始有较小钙化结节出现；4月龄小鼠脑中钙化比较明显，主要集中在丘脑；6月龄后小鼠脑部钙化非常明显，且主要分布于丘脑、纹状体、下丘脑、中脑、皮质和海马，丘脑钙化最为严重。以上结果证实IBGC颅内钙化的发生发展是动态的，可随时间的进展而加重。为了观察IBGC小鼠颅内钙化的精细结构，本研究选取6月龄Slc20a2-KI纯合小鼠脑组织进行亚显微结构观察，发现钙化结节大小不一、形状不规则，内部电子密度高低不等呈同心圆板层排列。
在IBGC患者中发现随着年龄增加，严重的颅内钙化引起许多锥体外系的临床表型，本研究建立的Slc20a2-KI纯合小鼠是否有异常行为？选取14月龄小鼠进行行为学检测，与WT小鼠相比，Slc20a2-KI纯合小鼠呈现出平衡与运动能力变差、焦虑情绪减少以及学习与记忆能力降低等表型。以上结果表明，Slc20a2-KI纯合小鼠模拟了IBGC患者临床表型，是一个很好的IBGC疾病模型。此外，与IBGC患者类似，Slc20a2-KI纯合小鼠的生殖、生长发育等情况正常，这不仅有利于小鼠快速繁殖，加快实验进程，而且在药物研究中，便于观察药物对小鼠身体的副作用影响。
本课题组早期体外实验发现SLC20A2突变造成PiT2的Pi转运障碍，推测在脑中可能会导致胞外Pi累积，造成局部Pi浓度升高，进而引发脑部钙化。为了在体内验证，本研究分别提取2月龄WT、Slc20a2-KI杂合和Slc20a2-KI纯合小鼠的脑脊液（CSF）和血清，通过钼酸盐-孔雀石绿分光光度法测定Pi浓度，Slc20a2-KI纯合小鼠CSF的Pi浓度（平均值=1.858mM）与WT小鼠（平均值=1.149mM）相比显著升高，而Slc20a2-KI杂合小鼠CSF的Pi浓度（平均值=1.163mM）与WT小鼠无显著差异，此外3种基因型小鼠血清Pi浓度（WT平均值=3.961mM，Slc20a2-KI杂合平均值=3.996mM，Slc20a2-KI纯合平均值=3.857mM）无显著差异。以上结果说明，PiT2对于维持CSF中Pi稳态发挥重要作用，而CSF中Pi浓度的升高很可能是导致脑部钙化形成的病理生理基础。
为了进一步揭示SLC20A2突变导致颅内钙化发生的分子机制，应用蛋白质组学技术对WT、Slc20a2-KI纯合和Slc20a2敲除（Slc20a2-KO）纯合小鼠脑组织的差异表达蛋白进行分析，与WT小鼠相比，Slc20a2-KI纯合和Slc20a2-KO纯合小鼠脑中的骨调素、骨钙素和胶原蛋白IV表达量都升高；通过实时定量PCR实验进一步验证它们的mRNA水平也显著增高。免疫组织化学染色发现，骨调素和胶原蛋白IV与颅内钙化结节明显共定位，二者可能是颅内钙化的部分有机成分；检测CSF中骨调素，发现与WT小鼠相比，Slc20a2-KI纯合小鼠在3月龄时CSF中骨调素的浓度显著增高，可能是颅内钙化的标志性蛋白。进一步对Slc20a2-KI纯合小鼠组织学观察，发现大量初始形成的微小钙化结节与血管直接相连，在钙化周围存在大量细胞外囊泡。检测与血管钙化相关的蛋白发现，碱性磷酸酶和骨保护素与颅内钙化结节也具有明显的共定位。
本研究选择依替膦酸二钠，对Slc20a2-KI纯合小鼠进行长期口服给药，分别比较4、5、6和7月龄的正常组和依替膦酸二钠组的Slc20a2-KI纯合小鼠，发现两组小鼠颅内的钙化程度都没有明显差异，表明依替膦酸二钠对小鼠颅内钙化没有抑制作用。同时，通过对Slc20a2-KO纯合小鼠进行为期1个月的低磷饮食，发现2月龄Slc20a2-KO纯合小鼠（还未出现颅内钙化），低磷饮食可以将CSF中异常增高的Pi浓度降低至正常水平，并且有效抑制其颅内钙化的发生；对于3月龄Slc20a2-KO纯合小鼠（已出现颅内钙化），低磷饮食可以部分降低CSF中异常增高的Pi浓度，对颅内钙化的累积速度具有一定的延缓作用。但低磷饮食也引起小鼠血清Pi浓度下降，长期低磷饮食会导致低磷血症。因此，低磷饮食对IBGC患者有一定的副作用，但可以有效抑制或延缓颅内钙化形成，这对IBGC发病机制的理解及对其预防与治疗研究的探索具有很大帮助。
总之，本研究成功构建了一个对人类IBGC疾病模拟程度非常高的Slc20a2-KI纯合小鼠模型，证实颅内钙化的发生的确与脑内Pi稳态失衡有关；首次揭示了骨调素、胶原蛋白IV、碱性磷酸酶和骨保护素与颅内钙化的形成有关，是颅内钙化的部分有机组成成分，并且CSF中的骨调素浓度异常升高，可能是颅内钙化的标志性蛋白；确定了PPi的类似物依替膦酸二钠对Slc20a2-KI纯合小鼠颅内钙化没有抑制效果；而低磷饮食，可以通过改善小鼠脑内Pi稳态，有效抑制Slc20a2-KO纯合小鼠颅内钙化的发生和累积速度。上述研究促进了人们对IBGC致病机理的理解，为IBGC防治奠定基础。