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白细胞介素-2(IL-2)是动物细胞免疫的重要组分,是调节细胞免疫的关键因子之一,也是疾病治疗免疫辅助剂,是医学上器官移植免疫学研究的热门攻关课题。由于猪的器官与人的类似,医学上常采用猪作为人医药研究模型。目前,有关猪IL-2在异源生物中表达的研究报道很少,加上猪品种间基因存在一定的差异,有必要进一步开展这方面的研究。本研究旨在克隆内江猪的IL-2,测定其DNA序列,对内江猪IL-2进行原核表达,测定原核表达蛋白的生物活性,最终获得一株新构建的能表达IL-2的大肠杆菌,为IL-2的大量生产和内江猪的开发利用提供技术保障。我们在试验过程中,参照GenBank中猪IL-2的mRNA序列(X58428)设计合成了一对引物,以从内江猪外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用两步PCR法扩增出了长度为538bp的内江猪IL-2片段。并将该基因克隆到PMD18-T-Vector载体上,经酶切鉴定及DNA序列测定确定该基因片段为内江猪IL-2基因。该基因包括内江猪IL-2基因的全部开放阅读框(ORF),编码155个氨基酸组成的蛋白质。与GeneBank公布的猪IL-2基因相比,在ORF的245位发生A→T、在257位发生T→A的置换,并引起相应氨基酸序列发生变化;同源性分析表明,二者同源性为99.6%。再分别利用在引物上所加的和PET-32a(+)质粒本身所带的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点,将PCR扩增得到的内江猪IL-2片段插入到PET-32a(+)质粒中,构建表达载体PET-32a(+)-IL-2,进而转化进入大肠杆菌BL21(DE3)。经酶切和菌落PCR鉴定重组子,证实了表达载体构建正确。以IPTG诱导重组菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE电泳分析,重组菌表达了分子量约37KD的融合蛋白;证实了PET-32a(+)-IL-2能够实现IL-2的原核表达。再用ConA刺激、活化后的淋巴细胞作为应答细胞,以所表达的内江猪IL-2融合蛋白做待检测对象,用MTT法检测所表达的融合蛋白的生物活性,结果显示,所表达的融合蛋白具有生物活性;并对淋巴细胞活化时间,MTT用量,MTT作用时间等试验参数进行研究,得出了MTT法检测该蛋白活性的最佳条件。 本研究成功地构建了一株能表达内江猪IL-2的菌株,该菌株有可能直接商业化,对人体医学研究和动物疾病疫防具有重要意义。