研究背景： 我国胃癌发生率在各类恶性肿瘤中位居第二，但其死亡率居各类恶性肿瘤之首。胃癌的病因不明确，尽管人们近年来关于胃癌癌基因和抑癌基因等方面的认识在不断的深化，但仍不清楚胃癌多阶段癌变过程的分子机理。全面了解胃癌癌变过程中的基因表达谱变化，并筛选出胃癌的相关基因，将为解决胃癌的诊断和治疗等问题提供关键的线索。随着人类基因组计划的顺利实施，基因表达及基因功能成了生命科学研究的热点，基因芯片技术是近年来出现的分子生物学与微电子技术相结合的新的检测技术，目前已广泛应用于基因表达研究。研究目的： 1 应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因，探讨胃癌发生发展的分子机理。 2 研制出人胃腺癌相关基因芯片。 3 研究免疫球蛋白（Ig）轻链kappa（Igκ）和lambda（Igλ）在胃癌细胞中的表达状况，以及Igκ和Igλ在胃癌细胞中表达的一致性。 研究方法： 1．人胃腺癌及相对应的正常胃组织标本取自解放军总医院，新鲜手术标本离体后立即冻存于液氮中。总RNA的提取采用TRIzol reagent。 2．含18000个基因克隆的cDNA膜基因芯片由上海细胞生物学研究所Max-Plank客座实验室制作。6对胃腺癌及正常胃组织的mRNA提取按Qiagen公司的mRNA提取试剂盒操作，cDNA探针以³³P-dATP标记，用逆转录法标记探针，杂交炉内杂交，洗膜，磷屏显影，扫描分析，扫描图像成对进行一一对比。 对差异表达基因在上述标本中的表达状况，进一步运用原位杂交和免疫组织 解放军总医院 杨少波 博1：学位论文 车医进修学院 人胃腺癌相关基H谱研究 化学技术进行检测验证。原位杂交探针用Bio－11－dUTP进行标记。免疫组织化学 检测使用LSAB法。 2．人胃腺癌相关基因芯片的制作 所研制的玻璃载体基因芯片上每个基因点两点，所选5兀基因克隆的＊＊R产 物均经测序确定，用点样仪按微矩阵排列点样于化学涂层的载玻片上，经系列处理 固定于载玻片上，即制成基因芯片。 胃腺癌和正常胃组织的总RNA分别直接进行逆转录反应，同时进行荧光素标 记CDNA产物用作杂交探针，等量探针混合后与上述基因芯片进行杂交。严格洗片 后扫描其上的荧光信号，然后分析比较两种组织间的差异。 3运用免疫组织化学技术L％B法对22例石蜡包埋人胃癌组织标本ig。和 Ig入进行检测。 结果： 1．II＄床胃腺癌与相对应的正常胃组织均经病理证实；凝胶电泳显示每例均提 取到优质RNA。 2．膜基固芯片杂交结果6对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较，筛选出 在 3例以上标本中有 2倍以上改变的基困克隆共有 103条(1条在所有病例中均差 异明显＼其中胃癌组织表达上调基因56条，胃癌组织表达下调基因47条。 对两个膜基困芯片杂交显示明显差异表达的基因 SNC73（f067420，克隆号 GKCFOC02）和 TIMP－l（X0312．克隆号ADCAXD12）．运用原住杂交检测其在6 对胃癌及相对应胃正常组织标本的表达．结果显示SNC73在胃癌组织中表达均低 于正常胃组织，6 TIMP八在胃癌组织中表达均高于正常胃组织，结果与膜基因芯 片杂交一致。运用 TIMP－1（C－20）山羊抗人 TIMP－1多克隆抗体，检测 TIMP－1在 6对 胃癌及相对应胃正常组织标本的表达，TIMP＜在胃癌组织中表达均高于正常胃组 织，进一步从蛋白质水平证实膜基因芯片杂交结果。 3．人胃腺癌相关基固芯片包含 103个上述研究中筛选的人胃腺癌差异表达基 6 解放车总医院 杨少波 博卜学位论文 军医进修学院 人胃腺癌相关基因谱研穴 困，以及一些巳知的胃癌相关基因（如P21ras，P53等）和检测控制基队 运用此芯片检测10对胃癌及相对应胃正常组织标本结果显示，每一杂交点均 清晰，无污点和点间融合，背景较为一致，阴性对照点无反应，看家基因点的亮度均 匀。胃癌的 CDNA探针以Q－5荧光素（呈红色）标iC，而正常胃组织 CDNA探针以h－3 荧光素（呈绿色）标记，杂交图上红缘颜色的差别反映了该基因在胃癌和正常胃组 织的表达水平上的差异，红色点表示胃癌组织该基困表达上调，绿色点表示胃癌组 织该基困表达下调，黄色代表表达水平一样。胃癌组织与正常胃组织相比，在5对 ?