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目的:本课题在前期研究中发现MLL2是哈萨克族食管癌中差异突变基因之一,但目前未发现MLL2与食管癌相关的研究报道。本研究拟在前期研究的基础上,进一步研究MLL2基因在哈萨克族食管鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,分析MLL2表达与食管癌临床病理特征和预后之间的关系。并在细胞和动物水平上进一步探讨MLL2对食管癌细胞增殖、侵袭及迁移等生物学行为的影响;并初步探讨其在食管鳞癌中发挥促癌作用的分子机制。方法:(1)分别利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫组织化学法检测哈萨克族食管癌患者癌组织及癌旁正常组织中MLL2的mRNA及蛋白表达水平,其中用于qRT-PCR检测的患者42例,用于免疫组化检测的患者67例。并分析MLL2蛋白表达水平与食管癌临床病理特征和患者预后的相关性。(2)利用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除食管癌细胞系Eca109中的MLL2基因,根据MLL2序列设计三个sgRNA干扰靶点序列,选取其中敲除效率最高的sgRNA用于后续细胞功能实验。敲除成功后,采用MTT和克隆形成实验检测MLL2敲除对食管癌细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及周期改变;细胞划痕和Transwell实验检测对食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响。(3)通过裸鼠皮下移植瘤和尾静脉-肺转移实验研究MLL2在体内对食管癌细胞增殖和转移等方面的影响。(4)利用Western blot技术检测MLL2表达对Eca109细胞和裸鼠皮下移植瘤中EMT相关蛋白(E-cadherin和Vimentin)和TGF-β/Smad通路相关蛋白表达的影响,分析MLL2与EMT之间的相关性及其可能的作用机制。利用免疫组织化学技术在组织水平上检测了EMT和TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达,进一步在组织水平验证MLL2与EMT之间的关系。结果:(1)qRT-PCR及免疫组化结果均显示MLL2在哈萨克族食管癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义。且进一步分析MLL2蛋白表达水平与临床病理特征之间的关系,发现MLL2表达与TNM分期(P=0.037)、分化程度(P=0.032)和肿瘤大小(P=0.035)有关,即MLL2高表达的患者肿瘤TNM分期越晚、分化程度越差、肿瘤体积越大。Kaplan-Meier生存分析结果显示MLL2与食管癌患者预后明显相关,MLL2高表达的患者生存率明显低于低表达患者(P=0.011,Log-rank检验),Cox多因素分析结果显示淋巴结转移和分化程度是食管癌预后的独立危险因素。(2)在体外Eca109细胞中敲除MLL2基因后,MTT及克隆形成实验结果显示食管癌细胞增殖能力显著降低;FCM检测发现细胞周期停滞在G1期,但其对细胞凋亡无显著影响;细胞划痕实验结果显示MLL2敲除后食管癌细胞迁移能力显著减弱,Transwell侵袭实验显示MLL2敲除后食管癌细胞侵袭能力也受到显著抑制。(3)裸鼠皮下移植瘤实验中,MLL2过表达组肿瘤生长速度显著高于对照组,MLL2敲除组肿瘤生长速度则显著低于对照组(P<0.05)。MLL2过表达组肿瘤重量显著高于对照组,敲除组的肿瘤重量显著低于对照组(P<0.05)。随MLL2表达水平升高,食管癌细胞体内成瘤能力增强。尾静脉-肺转移实验结果显示MLL2过表达组中肺转移结节数目显著多于对照组(P<0.05),MLL2过表达能显著增强食管癌细胞在体内的远处转移能力。(4)Western blot结果显示敲除MLL2后,食管癌细胞中上皮细胞标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达降低,而间质细胞标记物波形蛋白(Vimentin)表达上调,提示MLL2与EMT有关,且敲除MLL2后细胞中EMT受到抑制。MLL2敲除后,食管癌细胞中Smad7和Smad2/3蛋白表达升高,而磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)表达降低,说明MLL2敲除后细胞中TGF-β/Smad通路也受到抑制。在裸鼠皮下移植瘤组织中也检测上述相关蛋白表达情况,发现随MLL2表达水平升高,E-cadherin和Smad7蛋白表达降低,而Vimentin和p-Smad2/3蛋白表达水平升高,表明MLL2在体内也可促进EMT的发生和TGF-β/Smad通路的激活。为在组织中验证上述实验结果,在哈萨克族食管癌组织中检测E-cadherin、Vimentin和Smad7蛋白的表达,发现与癌旁组织相比,癌组织中E-cadherin和Smad7蛋白表达下降,而Vimentin蛋白表达升高。分析它们与MLL2表达之间的关系,发现E-cadherin蛋白在MLL2高表达的患者中的表达显著低于MLL2低表达的患者,Vimentin蛋白在MLL2高表达的患者中的表达显著高于MLL2低表达的患者,这也与之前的实验结果相一致。而Smad7蛋白在两组患者中的表达无明显差异,但在MLL2低表达的患者中Smad7蛋白的表达染色评分高于MLL2高表达的患者,这一趋势也与之前Western blot结果相一致。结论:MLL2在哈萨克族食管鳞癌中呈高表达,其表达水平与患者TNM分期、分化程度和肿瘤大小有关,且与患者预后显著相关。MLL2在体外和体内均可促进食管癌细胞的增殖、侵袭和转移,在食管癌发生发展中发挥癌基因的作用。MLL2在食管癌中与EMT有关,MLL2可促进EMT的发生,其可能的机制是MLL2通过抑制Smad7蛋白的表达而导致其不能发挥对TGF-β信号转导通路的抑制作用,从而促进EMT的发生。本研究结果也表明MLL2可成为新的预测食管癌预后的指标和一个潜在的治疗靶点。