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毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统因其兼具真核生物和原核生物的特点,自投入使用以来,已成功使用该系统表达了超过1000种的外源蛋白。作为外源蛋白表达系统,表达量是其最核心的评价指标之一。在毕赤酵母中,虽然有一些蛋白能得到高分泌表达,但多数蛋白在毕赤酵母中分泌表达量只能达到mg/L级。因此,如何找到一种普适性的方法,提高毕赤酵母中信号肽引导的外源蛋白分泌表达量,这对于完备毕赤酵母表达系统具有重要的意义。信号肽是分泌蛋白进入分泌通道重要先决条件,对蛋白的分泌表达有重要影响。本研究从信号肽入手,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告蛋白,研究S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种酵母α-factor信号肽及其前导肽对报告蛋白分泌表达的影响。研究发现,S.cerevisiaeα-factor信号肽可以很好的引导EGFP的分泌表达,而K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下;S.cerevisiaeα-factor信号肽引导的外源蛋白胞外表达量是K.pastoris和K.phaffii的98.2倍和13.5倍。从外源蛋白胞内滞留、蛋白降解、基因整合拷贝数、转录水平、密码子偏好性等方面对S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种α-factor信号肽进行分析,发现K.pastoris和K.phaffii的α-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下并非是这些原因造成。对三种α-factor信号肽潜在N-糖基化位点进行分析,发现S.cerevisiaeα-factor信号肽的前导肽上存在三个N-糖基化位点,而在K.pastoris和K.phaffii的α-factor上没有N-糖基化位点。将S.cerevisiaeα-factor前导肽三个N-糖基化位点上的N突变成Q,使之不能被N-糖基化,其表达量下降了近50.3%。同时,在K.pastoris和K.phaffiiα-factor前导肽上引入一个N-糖基化位点后,表达量有显著提高,分别提高了31.5倍和5.2倍。这些结果说明α-factor前导肽的N-糖基化修饰有助于外源蛋白的分泌表达,K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽不能很好引导外源蛋白的分泌是由于缺少N-糖基化而引起的。进一步以S.cerevisiaeα-factor信号肽为模型,研究前导肽上N-糖基化的数量和位置对分泌表达的影响,结果表明,前导肽上N-糖基化的数量和位置对表达量没有明显影响。本研究为提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供了技术手段,也为进一步的机制研究奠定很好的前期基础,同时,也为外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达所需的信号肽提供了更多的选择。