论文部分内容阅读
目的:肿瘤是对人类生命威胁最大的疾病之一,早发现、早诊断对于及时开展肿瘤早期治疗、降低肿瘤死亡发生率、提高肿瘤的预后具有重要意义。外泌体作为由细胞分泌的具有脂质双分子层结构的纳米微囊泡,在血液、唾液、尿液、脑脊液等多种体液中广泛存在,是细胞间分子通讯的重要途径,参与机体的免疫反应、器官发育、生殖功能等生理活动及癌症的形成与进展、心血管疾病、病毒传播等病理活动。唾液外泌体来源于唾液,其内容物大部分与血浆类似,是一种真正无创且取样简便的液体活检样本来源。一些研究表明,唾液外泌体内的肿瘤标记物不但与颌面部肿瘤密切相关,同时对于部分远端肿瘤的检测及预后监测也具有重要作用。除了常见的编码RNA,近期研究表明,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）的表达失调也与肿瘤的发生及发展关系密切。但是,唾液外泌体中lncRNA的含量较少,采用传统的方法难以检测。因此,本课题设计并制备了一种基于微流控方法的数字PCR芯片,通过靶基因引物的筛选及探针特异性的提升,实现唾液外泌体内肺癌特异性肿瘤标记物lncRNA的检测,为建立新型的高灵敏度、高特异性的唾液外泌体肿瘤标志物的检测方法提供新思路。方法:1)芯片的设计和制作:采用多层光刻技术,以硅片为基底,制作模板。然后将PDMS浇筑在硅片模具上,加热固化。用热键合的方法使PDMS芯片与玻片紧密的贴合在一起。2)dPCR芯片灵敏度测试:将H1975细胞cDNA梯度稀释成不同的浓度,进行PCR反应体系检测,分析芯片的线性范围及检测灵敏度。3)唾液样本收集及处理:唾液样本收集至50ml离心管中,收集的过程应全程置于冰上。唾液外泌体RNA的提取采用QIAGEN的exoRNeasy Serum/PlasmaMidi Kit试剂盒进行,得到的外泌体RNA保存于-80℃。4)唾液外泌体RNA反转录:按SuperScript III First-Strand Synthesis System试剂盒提供的说明书进行唾液外泌体RNA反转录,将反转录得到的cDNA保存于-80℃。5)引物效率及特异性验证:利用LightCycler 480 II以及Bio-rad凝胶电泳仪对靶基因的引物的特异性进行验证,根据qPCR结果及电泳图进行分析,完成靶基因引物的筛选及探针特异性的提升。6)qPCR与dPCR检测结果比较:选取相同的样本分别用于qPCR与dPCR检测,对两种方法的检测结果进行比较。7)唾液外泌体lncRNA定量分析:采用微流控芯片检测靶基因在肿瘤及健康对照人群的唾液外泌体中的表达差异,并使用双尾t-test进行分析。结果:1)设计了一种基于微流控方法的数字PCR芯片应用于唾液外泌体内肺癌特异性肿瘤标记物lncRNA的检测。芯片主要由进样区、微室区以及出样区三部分构成,各个微室及进、出样口由微管道连接形成一个整体。采用光刻技术制作硅基模板,并使用PDMS制备芯片,之后采用热键合的方法使所制备的芯片与玻片（涂抹PDMS薄膜）键合在一起,完成芯片组装。通过测试,该芯片的检测限为10 copies/μL,满足唾液外泌体lncRNA检测的需要。2)利用微流控芯片检测唾液外泌体中肺癌肿瘤标记物的表达情况。qPCR实验测试了靶基因引物及探针的特异性及效率。基于前期的研究,对lncRNA uc011cly.2和NR046326两个肺癌相关标记物进行了数字PCR检测。实验结果与同期患者血浆外泌体的检测结果一致,靶基因在肿瘤及健康对照人群中的表达差异显著,P<0.001。我们还将dPCR结果与qPCR结果进行了比较,实验表明,微流控芯片具有更高的灵敏度。结论:唾液外泌体内的肿瘤标记物与远端肿瘤的发生及发展之间存在着重要的联系。我们通过对基于微流控的数字PCR芯片方法进行探索,检测了唾液外泌体内的lncRNA与肺癌的相关性。结果表明微流控芯片可用于唾液外泌体的检测,且唾液外泌体中的肺癌特异性标记物检测为肺癌生物标记物检测提供了一个新策略。