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玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus是一种重要的昆虫病原真菌,在生物防治中是一种重要的生物杀虫剂,具有无污染、触杀性和昆虫不易产生抗性等优点,但是同其它杀虫真菌一样,也存在对环境要求高、致死效果较差、防效不稳定等缺点。成功突破昆虫体壁是昆虫病原真菌侵染昆虫的首要步骤,也是决定其致死力和毒力的重要因素。而几丁质酶和蛋白酶可以降解昆虫体壁,是消灭昆虫体壁屏障的重要“武器”。因此,几丁质酶和蛋白酶是昆虫病原真菌侵染虫体的重要毒力因子,为此几丁质酶和蛋白酶(包括几丁质酶源和蛋白酶源)的研究已成为病原真菌研究的一个热点。但目前对玫烟色拟青霉几丁质酶和蛋白酶的研究还有待深入。本研究即明确了以玫烟色拟青霉为目标菌种,开展该菌种几丁质酶和蛋白酶的基因克隆和重组表达载体构建的研究思路,并开展完成了以下工作：1、分别以基因组DNA和反转录的cDNA为模板,经PCR扩增,从玫烟色拟青霉中成功克隆到几丁质酶基因chit2和蛋白酶基因pr1。2、克隆到的几丁质酶基因chit2序列全长1744bp；有3个内含子,长度分别是56bp,46bp,50bp,内含子含有典型的内含子边界序列GT...AG;开放阅读框全长1272bp,起始密码子(ATG)和终止子(TAA)分别在110碱基和1539碱基处,编码423个氨基酸；5’端非翻译区(5’UTR)与3’端非翻译区(3’UTR)分别为109bp和203bp。通过Blast对保守区进行预测,发现该几丁质酶基因含有FDGIDIDWE和SIGGW活性位点,属于糖基水解酶18家族。其与渐狭蜡蚧菌几丁质酶(Lecanicillium attenuatum, endochitinase? AGS12320),莱氏野村菌几丁质酶(Nomuraea rileyi, chitinase, ACF10394),球孢白僵菌几丁质酶(Beauveria bassiana, endochitinase, AAN41260),钩状木霉几丁质酶(Trichoderma hamatum, chitinase, AAC60385),哈次木霉几丁质酶(Trichoderma harzianum, chitinase, ACI43058)的序列同源性分别为87%,75%,73%,72%,71%。该几丁质酶既具有外切酶活性,又具有内切酶活性。3、克隆到的玫烟色拟青霉类枯草蛋白酶基因序列全长为1632bp；包含3个内含子；开放阅读框长1143bp,编码380个氨基酸。信号肽长度为15个氨基酸,成熟的蛋白理论分子量为39kDa。其与刀孢轮枝菌蛋白酶(Lecanicillium psalliotae, alkaline serine protease, AAW65381),球孢白僵菌蛋白酶(Beauveria bassiana, serine proteinase, ACZ28128),绿僵菌蛋白酶(Metarhizium lepidiotae, subtilisin-like protease Pr1A, ACV71862),淡紫拟青霉蛋白酶(Purpureocillium lilacinum, serine protease, AAA91584)的序列同源性分别为为80%,76%,64%和64%。4、成功构建了pET-28a-Pfchit2. PET-32a-Pfchit2、pPICZB-Pfchit2三个几丁质酶重组表达载体,pET-28a-Pf Prl、pET-32a-Pf Pr1、pPICZB-Pf Pr1三个蛋白酶重组表达载体。进一步在大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统中进行两种酶的表达检测,发现：chit2和Prl均可大量表达,但表达蛋白都以包涵体的形式存在。5、对玫烟色拟青霉菌几丁质酶产量条件进行优化,发现培养72小时时酶产量最高：添加2%NaNO3可以显著提高产酶量。该项研究为后续的几丁质酶和蛋白酶转基因工作奠定了基础。