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目的:明确宿主细胞基因组甲基化在HIV-1 Tat蛋白激活KSHV裂解周期中的作用,筛选参与HIV-1 Tat蛋白激活KSHV裂解周期的宿主细胞甲基化位点。方法:1.构建HIV-1 Tat重组慢病毒表达载体pCDH-GFP-Tat-F后,将构建的pCDH-GFP-Tat-F与慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞,组装HIV-1 Tat重组慢病毒pCDH-GFP-Tat-F,同时组装含pCDH-GFP空载体的慢病毒作为对照;2.HIV-1 Tat重组慢病毒pCDH-GFP-Tat-F感染BCBL-1细胞,通过荧光显微镜观察病毒感染效率;应用Western blotting检测Tat蛋白在宿主细胞的表达;利用Tat蛋白可激活HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)的特性,采用含LTR启动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的pTZIII-CAT质粒转染重组病毒感染24h的BCBL-1细胞后,以CAT-ELISA试剂盒检测Tat诱导的CAT表达,从而检测Tat蛋白的转录激活活性;3.利用real time PCR检测KSHV的裂解期及潜伏期基因的表达,分析Tat重组病毒感染对KSHV裂解复制周期的影响;4.应用重亚硫酸盐处理的第二代高通量DNA甲基化测序技术筛选表达Tat蛋白的BCBL-1细胞中宿主基因组的甲基化位点。结果:1.成功构建了pCDH-GFP-Tat-F慢病毒表达载体,并能在293T细胞内正确进行RNA转录与蛋白质表达,进一步包装获得重组慢病毒;2.组装好的慢病毒感染BCBL-1细胞,荧光显微镜观察感染效率达到80%以上。应用Western blotting技术检测到重组病毒感染的BCBL-1细胞内能正确表达Tat蛋白。同时用pTZIII-CAT质粒转染后,可检测到细胞中CAT表达,表明重组病毒表达的Tat蛋白具有活性。3.利用Real time PCR检测KSHV的裂解期及潜伏期基因结果显示裂解期基因PAN上调,潜伏期基因LANA基因下调,表明Tat蛋白能激活KSHV裂解复制;4.重亚硫酸盐处理的第二代高通量DNA甲基化测序结果显示Tat蛋白表达使宿主细胞很多染色体区域发生了甲基化改变,同时还分别筛选出9个甲基化升高的区域和8个甲基化降低的区域;GO分析结果显示,Tat蛋白引起的宿主细胞甲基化状态改变涉及6个细胞信号通路;KEGG信号通路注释筛选到15个具有统计学差异(即q-value<=0.01)的信号通路。结论:1.本次研究证实Tat蛋白激活KSHV裂解复制。2.宿主细胞的染色体区域甲基化可能参与Tat蛋白激活KSHV裂解复制。