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背景黑色素瘤作为一种致死性极高的皮肤肿瘤,寻找其新的治疗方法依然非常重要。目前,肿瘤免疫治疗,特别是免疫治疗联合其它疗法受到了人们越来越多的关注。IDO2作为一种具有免疫抑制作用的色氨酸犬尿氨酸代谢途径的限速酶,在黑色素瘤组织中高表达,显著抑制了机体的抗肿瘤免疫,成为了黑色素瘤治疗的一个新靶点。同时硝呋奇特作为一种肠道抑菌药,本课题组前期发现其能够抑制Stat3表达,具有一定的抗肿瘤作用。因此,该课题将探索减毒沙门氏菌运载自主设计的IDO2-siRNA联合硝呋奇特对黑色素荷瘤小鼠的治疗作用,并对其机制进行初探。目的探索减毒沙门氏菌运载IDO2-siRNA联合硝呋奇特治疗黑色素瘤的作用及作用机制。方法体外实验将处于对数生长期的RAW264.7细胞按照3×10~5/孔的密度铺制六孔板,培养16h之后分别加入不同浓度的IDO2-siRNA,提取24h及48h的细胞蛋白,应用Western blot检测IDO蛋白的表达。体内实验1.将状态极好的黑色素瘤细胞B16消化、重悬后计数,于老鼠右侧后腿部靠近背部约1cm处皮下注射0.1ml(1×10~6)B16黑色素瘤细胞。接种7天后,随机将小鼠分为五组:PBS组、Scramble组、IDO2-siRNA组、硝呋奇特组,硝呋奇特+IDO2-siRNA组(联合组),并开始以下治疗。A.第一疗程治疗(接种B16细胞7天后):药物治疗组每天打药治疗持续7天(200μg/只小鼠),Scramble组、IDO2-siRNA组,硝呋奇特+IDO2-siRNA组于第七天菌液治疗,一次性打入菌量4×10~5 CFU/只小鼠;B.第二疗程治疗(接种B16细胞14天后):Scramble组、IDO2-siRNA组,硝呋奇特+IDO2-siRNA组于第14天菌液治疗再次打入同样菌量。共计药物治疗七天,菌液治疗两次。第二疗程治疗结束后7天,分离小鼠的黑色素瘤组织,分别提取肿瘤组织中蛋白,通过Western blot方法检测肿瘤组织中IDO2和各种免疫分子的表达;应用FACS检测其对荷瘤小鼠脾脏中CD4~+、CD8~+等各淋巴细胞亚群的影响2.小鼠生存期统计:记录各组小鼠每天的存活数,观察应用不同治疗方法特别是减毒沙门氏菌运载IDO2-siRNA对黑色素荷瘤小鼠生存期的影响。3.数据处理方法及质量控制方法数据采用均数±标准差表示,统计软件采用SPSS19.0进行数据统计分析。两组间差异均采用t检验进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均采取三次独立重复实验来进行质量控制。结果1.细胞实验显示硝呋奇特显著抑制了B16细胞的增殖,增加了细胞的凋亡;2.IDO2-siRNA特异性地降低了RAW细胞中IDO的表达;3.在黑色素瘤异种移植动物模型中,联合治疗组小鼠生存率40%,即有效地抑制了小鼠肿瘤的生长;4.联合治疗显著抑制了黑色素瘤细胞中Stat3的磷酸化,抑制了IDO蛋白的表达;5.联合治疗组HE染色显示肿瘤细胞异型性减少,凋亡细胞增多;6.联合治疗增加了肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润;7.联合治疗有效增加了荷瘤小鼠脾脏中CD4~+及CD8~+T淋巴细胞的比率(30.6和23.4)。结论1.自主设计的IDO2-siRNA能够有效抑制细胞中IDO的表达;2.IDO2-siRNA联合硝呋奇特能够对荷瘤小鼠起到明显治疗作用,增强了荷瘤小鼠的免疫反应。