出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)又称黑酵母,是一种类酵母样真菌,在其发酵过程中会产生普鲁兰。普鲁兰是具有良好生物活性的大分子聚合物,在食品、医药、环保以及化妆品等众多领域都具有重要的应用价值。它的前体物质在细胞体内产生,在糖转运蛋白的帮助下分泌至胞外参与普鲁兰的合成。糖转运蛋白在微生物发酵过程中起着重要作用,不仅是参与细胞外糖分的吸收,还包括协助细胞中糖类代谢物的释放。本论文以出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M 2012259)为出发菌株,对其细胞中的糖转运蛋白进行了研究。我们预测其编码糖转运蛋白相关的基因信息,对这些基因进行敲除改造,筛选突变菌株,并从发酵过程、普鲁兰产量等方面与出发菌株进行比较,探究糖转运蛋白在出芽短梗霉合成胞外多糖过程中的作用。主要的研究内容及结果如下:1.在对本实验室一株出芽短梗霉进行全基因组测序的基础上,利用三种不同的生物信息学方法,即同源预测、从头预测以及基于RNA-seq的数据分析,将基因组信息与数据库中所有真菌已知的糖转运蛋白信息进行比对研究,初步筛选得到出芽短梗霉中可能的糖转运蛋白编码基因。接着采用GENSCAN软件对初步预测结果进行精确基因结构建模,得到包含启动子、外显子、内含子以及终止子的完整的基因信息。最后将预测得到的基因翻译成蛋白质序列,用blastp程序进行比对验证,最终确定出芽短梗霉的13个基因序列可能编码糖转运蛋白。得到的结构模型用ProcessOn软件进行基因序列以及蛋白质序列的可视化呈现。2.对预测的13个可能的糖转运蛋白基因序列进行克隆并构建相应的敲除载体。根据预测序列设计引物,将13个基因片段扩增到pMD19T载体上,测序得到包含内含子的全部序列,通过比对发现所有的外显子部分与预测序列完全匹配。接着在出芽短梗霉细胞中构建一个可以发挥功能的表达载体,包括启动子、终止子以及潮霉素筛选标记基因,即筛选元件PtrpC-hyg-TtrpC。最后通过酶切连接将有效元件插入到构建完成的13个糖转运蛋白候选基因的克隆载体上,完成用于同源重组的相应敲除载体的构建。3.利用基因工程手段对出芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M 2012259)中糖转运蛋白编码基因进行敲除。首先考察了出芽短梗霉的生长状态。在YPD培养基中对出芽短梗霉进行培养,绘制相应的生长曲线,结果发现,培养25 h左右细胞处于对数生长期,可以用于后续的电转化实验。其次,要确定合适的潮霉素抗性筛选浓度。结果发现在100 μg/mL的潮霉素筛选平板上没有任何菌落生长的痕迹。因此,选择100 μg/mL的潮霉素浓度作为筛选阳性转化子的条件。然后用构建好的敲除片段对出芽短梗霉中相应的糖转运蛋白基因进行敲除,成功得到突变株。最后在摇瓶培养条件下对出发菌株以及所构建的突变株进行发酵生产普鲁兰性能的考察,结果发现和原始菌株相比,突变株的细胞干重有所提高,而普鲁兰的产量明显下降。以上结果表明,本文所考察的糖转运蛋白可能在普鲁兰胞外分泌过程中发挥作用,为进一步从分子水平改造出发菌株以提高普鲁兰合成效率提供了有利的证据。