MPTP诱导的帕金森症模型中NADPH对多巴胺神经元的保护作用及其机制

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目的:观察在1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)诱导的帕金森症模型中Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH)对多巴胺能神经元的保护作用。研究在MPTP诱导的帕金森症模型中NADPH发挥对多巴胺能神经元的保护作用的机制。  方法:在MPTP腹腔注射C57BL/6小鼠制备的帕金森症小鼠模型和黑质多巴胺能神经元细胞系MES23.5细胞MPP+(MPTP的体内活性形式)体外干预模型的基础上,观察NADPH对MPTP造成的多巴胺能神经元损伤的保护作用并探讨其作用机制。在动物脑组织中以免疫组化及Western blot法检测中脑腹侧区和纹状体中多巴胺合成限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,THase)表达含量的变化以表征多巴胺能神经元的损伤情况。行为学检测小鼠的自发活动以及运动能力和平衡能力以研究DA神经元变性与恢复过程之间的关系。体外以MTT法检测NADPH对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用。运用NADPH/NADP+和GSH/GSSG试剂盒检测注射MPTP造模以及NADPH治疗后小鼠中脑腹侧区NADPH和GSH水平变化。用DHE探针标记检测小鼠中脑黑质区及MES23.5细胞中多巴胺能神经元内活性氧(ROS)水平的变化。用Western blot法检测造模及给药后小鼠中脑黑质区及MES23.5细胞中p38MAPK, TP53, Bax, PARP等蛋白含量的变化。用免疫荧光法观察小鼠中脑黑质区TP53的核转位情况,体外则用核质分离和Western blot法检测MES23.5细胞造模及给药后细胞核内TP53水平的变化。用Hoechst33342染色法对造模及给药后的MES23.5细胞核进行染色,以表征其细胞凋亡情况。为了探究p38MAPK通路在本模型中的作用,用p38MAPK的抑制剂SB203580进行相关实验。  结果:注射MPTP造模后,小鼠中脑黑质区及纹状体中THase阳性细胞丢失明显,而给予NADPH的治疗组则有所缓解;MPTP模型组中,小鼠中脑黑质区和纹状体中THase蛋白水平明显下降,而NADPH治疗组THase蛋白水平有明显回升。MPTP模型组中,小鼠中脑黑质区NADPH及GSH水平均明显下降,NADPH治疗组则有明显回升。在体外模型中,NADPH处理明显降低MPP+对MES23.5细胞造成的损伤,抑制MPP+诱导的cleaved-PARP蛋白水平升高,减少 MPP+引起的细胞凋亡。在动物及细胞模型中,NADPH能显著降低由MPTP/MPP+诱导的ROS水平升高,抑制由MPTP/MPP+诱导的p-p38, Bax等蛋白水平的升高,抑制由MPTP/MPP+诱导的TP53的核转位。  结论:NADPH对MPTP诱导的多巴能神经元损伤具有保护作用,其作用机制可能与NADPH抑制ROS,进而抑制p38MAPK-TP53通路,最终减少细胞凋亡有关。NADPH的应用可能为抗氧化剂治疗帕金森症提供一个新的潜在化合物。
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