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脂肪酸脱饱和酶是一类负责催化与不同载体结合的饱和脂肪酸在其碳链上引入不饱和双键的酶,具有控制细胞内不饱和脂肪酸含量的功能。依据其催化底物所结合载体的差异,脂肪酸脱饱和酶可以分为脂酰CoA脱饱和酶、脂酰ACP脱饱和酶以及脂酰-酯脱饱和酶。
自然界的细菌体内,主要存在两条形成不饱和脂肪酸的途径。第一条途径依赖于Ⅱ型脂肪酸生物合成系统。FabA以β-羟基癸酰基ACP为底物,执行脱水和异构化反应来产生顺式-3-癸烯酰ACP,并通过FabB对顺式-3-烯酰中间物进行延伸。第二条途径是以脂酰CoA或膜磷脂为底物进行脱饱和反应。脂肪酸脱饱和酶是第二条途径的关键酶,它以细胞色素b5或者铁氧还蛋白为电子供体,识别脂酰链上的特定位置并进行脱饱和反应。细菌当中,枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌的脂肪酸脱饱和酶被研究得较为透彻。
在苜蓿中华根瘤菌中存在两个脂肪酸脱饱和酶蛋白DesA1和DesA2,它们与枯草芽孢杆菌Des蛋白的相似度为44%和22.4%,并且都拥有脂肪酸脱饱和酶家族特有的三个富含组氨酸的基序。在此情况下,本研究围绕苜蓿中华根瘤菌中不饱和脂肪酸的合成代谢,通过体内遗传互补和突变株构建两个方面,研究desA1和desA2两个基因编码的蛋白在不饱和脂肪酸合成中的功能,并初步探索脂肪酸脱饱和酶在根瘤菌共生固氮反应和适应外界环境过程中的作用。
本研究克隆了苜蓿中华根瘤菌的desA1和desA2两个基因,构建出体内互补用的pBAD24系列载体。将pBAD24系列质粒载体转化大肠杆菌fabA温度敏感突变株CY57,进行体内遗传互补和薄层色谱分析,结果显示苜蓿中华根瘤菌desA1基因所编码的蛋白能使CY57产生可检测的不饱和脂肪酸,而desA2基因却无互补功能,初步表明苜蓿中华根瘤菌DesA1具有脂肪酸脱饱和酶活性。
为了进一步研究体内DesA1和DesA2在不饱和脂肪酸合成代谢方面的功能,本研究对苜蓿中华根瘤菌desA1和desA2进行敲除,最终获得了SMa2T(ΔdesA1)、SMb2T(ΔdesA2)和SMab2T(ΔdesA1desA2)三个突变株。磷脂中脂肪酸组分的测定结果显示,野生型与突变株细胞中均含有大量的不饱和脂肪酸,约占脂肪酸总量的75%,而野生型与突变株之间,脂肪酸组分的差别不大。在对突变株生理学研究中发现,desA1的缺失突变削弱了苜蓿中华根瘤菌适应外界环境的能力,使其结瘤能力降低,不利于宿主植物根系的生长,暗示了DesA1在共生固氮作用和细菌适应性中起着一定作用。相比之下,desA2的缺失突变对苜蓿中华根瘤菌的影响不大。