【摘 要】
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代谢工程或合成生物学是通过构建合成通路或调控代谢流,实现合成特定化学品的目标,这个过程涉及到筛选合适的酶进行生物催化过程将出发底物逐步转化为目标产品。然而,由于酶的非特异性和一些中间代谢物自发发生的反应,导致产生无用的或有毒的代谢产物,若该过程不加控制就会对细胞自身的代谢途径和工程化代谢途径产生非常大的影响。近十年来随着多种修复酶的发现,代谢损伤反应已被人们普遍认可,然而将代谢物损伤修复应用到合成
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（NO.2018YFA0901700）；
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代谢工程或合成生物学是通过构建合成通路或调控代谢流,实现合成特定化学品的目标,这个过程涉及到筛选合适的酶进行生物催化过程将出发底物逐步转化为目标产品。然而,由于酶的非特异性和一些中间代谢物自发发生的反应,导致产生无用的或有毒的代谢产物,若该过程不加控制就会对细胞自身的代谢途径和工程化代谢途径产生非常大的影响。近十年来随着多种修复酶的发现,代谢损伤反应已被人们普遍认可,然而将代谢物损伤修复应用到合成生物学或代谢途径设计和具体实践中则鲜见报道。为了探究损伤修复对代谢工程的影响,本研究选用毕赤酵母作为出发菌株,通过基因工程向菌株中分别引入四种外源的乳酸脱氢酶基因,构建了合成乳酸的工程酵母菌株,其中枯草芽孢杆菌来源的乳酸脱氢酶效果最好,乳酸产量可以达到38.9 g/L。在此菌株基础上本研究进一步探究了不同修复酶对细胞代谢有害物质的清除作用,通过向乳酸合成工程酵母中分别引入NAD（P）HX差向异构酶（NAXE）、NAD（P）HX脱水酶（NAXD）、NAD（P）HX差向异构酶与NAD（P）HX脱水酶的组合（NNR）以及磷酸乙醇酸磷酸酶（PHO13）,通过对高拷贝菌株筛选以及液相色测谱分析检测乳酸含量,根据乳酸含量变化,分析不同修复酶对有害物质的清除作用以及对乳酸产量的影响.研究发现分别引入以上修复基因后,乳酸产量明显上升,即磷酸盐修复以及NADPH修复系统能有效清除有害物质,提高代谢速率,进而提高乳酸产量。同时,我们也证明了来自凝结芽孢杆菌的乳酸转运蛋白基因,能够在毕赤酵母中正常表达,并将乳酸由胞内转至胞外提高乳酸产量。综上所述,本文构建了基于酵母的乳酸合成菌株,证实了工程化菌株合成化学品过程中确实会产生有毒代谢物积累,并可以通过引入合适的修复蛋白进行修复,从而提高目标化学品的合成,该研究为代谢工程高效合成化学品提供了新的思路。
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