葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phospho isomerase)又称为磷酸麓萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase)简称GPI，是一种糖代谢途径中催化葡萄糖-6-磷酸与果糖-6.磷酸之间相互转化的异构酶。GPI在所有真核生物及原核生物细胞中普遍存在、具有高度保守性，但是其功能多样，通常为同二聚体分子。在不同生物中，GPI的分子量存在差异，但是其功能区域相当保守，在不同生物中具有很高的同源性。　　 近年来的研究结果显示，GPI作为非常保守的异构酶，不仅参与糖代谢，而且还具有一特殊的功能，如在动物细胞中作为自分泌运动因子(AMF)促进肿瘤细胞移动、增殖和浸润；作为神经白细胞素(NLK)，帮助培养的感觉神经元和特殊的胚胎脊髓神经元存活；作为一种成熟因子(MF)介导人类骨髓白血病HL.60细胞分化为终端单核细胞。研究发现，K/B×NT细胞受体转基因小鼠中抗GPI自身抗体对小鼠的类风湿性关节炎的发展有关。人类GPI酶活性的遗传缺陷主要影响红细胞，引起遗传的非球形红细胞溶血性贫血(HNSHA)。　　 杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种极度耐盐的单细胞真核绿藻，没有细胞壁，属于绿藻门，绿藻纲，团藻目。杜氏盐藻具有双鞭毛，可以游动，细胞内具有一个杯状的叶绿体，具有极强的光合作用。目前关于杜氏盐藻GPI(DsGPI)的研究仍是空白，而且没有针对DsGPI的商业化抗体出售，因此不能检测DsGPI在蛋白水平的表达情况。　　 本研究根据我们在GenBank上登录的序列设计引物克隆了DsGPI基因cDNA的开放阅读框(ORF)，构建了原核表达载体pET28a-DsGPI，诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经纯化获得了高纯度的DsGPI重组融合蛋白。通过免疫新西兰白兔，制备了兔抗DsGPI的特异性多克隆抗体。并利用自制的多克隆抗体在蛋白水平检测了盐胁迫状态下DsGPI的表达变化，完成了自制兔抗DsGPI多克隆抗体在DsGPI生物学功能研究中的首次应用。为进一步研究DsGPI与人AMF的关系，本研究还构建了荧光定位载体pEGFP-Cl-DsGPI，并将pEGFP-Cl-DsGPI与pEGFP-Cl-AMF转染狗肾上皮细胞MDCK，并在荧光显微镜下进行了亚细胞水平的定位。为进一步研究DsGPI与人AMF的功能相　　 关性进行了探索。　　 方法：　　 1 DsGPI ORF的克隆与序列分析　　 根据Genbank登录的DsGPI cDNA序列(GenBank登录号：FJ210719)设计引物，以提取的社氏盐藻总RNA为模板，RT-PCR扩增DsGPI的ORF全长并连接到pMD18-T载体上。测序结果与GenBank上登陆的DsGPI cDNA序列进行比对。　　 2 DsGPI基因原核表达载体的构建　　 将pMD18-DsGPI用NdeI和EcoRI双酶切后将目的基因定向插入到pET28a(+)中，构建原核表达载体pET28a-DsGPI并测序。　　 3 pET28a-DsGPI在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达与纯化　　 将测序正确的重组质粒pET28a-DsGPI转化感受态细菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，并进行SDS-PAGE蛋白电泳，检测蛋白表达情况。优化表达条件后大量表达目标蛋白，收集包涵体沉淀，经洗涤溶解后用Ni2+-NTA纯化柱纯化DsGPI重组融合蛋白，并进行定量。　　 4 DsGPI多克隆抗体的制备　　 将纯化后的DsGPI蛋白与弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射免疫新西兰白兔。每只的免疫蛋白量为1mg共免疫7次，末次免疫7天后颈动脉取血，闻接ELISA法检测抗血清滴度，Western blots检测抗体特异性。　　 5在盐胁迫环境下检测DsGPI的表达　　 将在正常UTEX培养基(1.5MNaCl)中生长的杜氏盐藻转入不同盐浓度的UTEX培养基(1.5M～3.5MNaCl)中进行盐胁迫状态下培养。在盐胁遥状态下培养16h后收集盐藻细胞，用盐藻蛋白提取液进行总蛋白的提取，并用自制兔抗DsGPI多克隆抗体按照Western blots方法检测不同盐浓度胁迫状态下DsGPI蛋白的表达情况。　　 6 DsGPI及人AMF在MDCK细胞中的定位　　 以杜氏盐藻cDNA为模板，设计引物，扩增两端具有BamHI和EcoRI酶切位点的DsGPI ORF序列，并定向插入荧光载体pEGFP-Cl多克隆位点中。将狗肾上皮细胞株MDCK接种于6孔板中培养，按LipofectamineTM2000转染试剂说明书将真核定位载体pEGFP-Cl-DsGPI和pEGFP-Cl-AMF进行转染，同时以转染空载体pEGFP-C1的细胞作为阴性对照。pEGFP-Cl-DsGPI和pEGFP-Cl-AMF转染MDCK细胞24h后，用显微荧光摄像/照相系统观察EGFP-DsGPI和EGFP-AMF融合蛋白在MDCK细胞中的定位。　　 结果：　　 1 DsGPI ORF的克隆与序列分析　　 用TRIzol试剂提取盐藻总RNA，提取的盐藻总RNA28S和18S条带清楚，纯度较高。利用RTPCR法得到1980bp的DsGPIORF全长，该序列编码659个氨基酸。经BLAST分析，与GenBank上登录的DsGPI序列ORF具有100％的同源性。　　 2 DsGPI基因原核表达载体的构建　　 NdeI和EcoRI双酶切重组质粒pET28a-DsGPI后得到约2000bp的条带，经测序鉴定该房列与GenBank已登录的DsGPI ORF序列完全一致。表明，原核表达载体pET28a-DsGPI构建成功。　　 3 pET28a-DsGPI在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达与纯化　　 IPTG诱导转化菌表达，SDS-PAGE结果显示在约78kDa处有一新的蛋白质条带，与DsGPI分子量大小一致，而对照菌株则没有相应蛋白的表达，证实DsGPI重组蛋自表达成功。包涵体蛋白经洗涤溶解后经Ni2+-NTA纯化柱纯化及SDS-PAGE分析，纯化后DsGPI蛋白的纯度达到96％。　　 4 DsGPI多克隆抗体的制备　　 将纯化的DsGPI蛋白免疫新西兰白兔后，采用间接ELISA法测定抗血清效价。结果显示免疫7次后抗血清滴度为1：512000。Western blots结果显示在约78kDa处有单一条带，表明DsGPI多克隆抗体制备成功。　　 5在盐胁迫环境下检测DsGPI的表达　　 SDS-PAGE分析可见，在DsGPI蛋白表达区(70kDa～80kDa)盐藻蛋白表达丰度相对稀少。以制备的DsGPI多克隆抗体作为一抗进行Western blots分析，结果显示随着盐胁迫浓度的升高，DsGPI的表达量也星明显增加趋势，在蛋白水平验证了DsGPI是一种盐适应性蛋白。　　 6 DsGPI及人AMF在MDCK细胞中的定位　　 BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pEGFP-C1-DsGPI后得到约2000bp的条带，经测序鉴定该序列与GenBank已登录DsGPI cDNA开放阅读框完全一致。将空质粒pEGFP-Cl和重组质粒pEGFP-Cl-DsGPI、pEGFP-Cl-AMF转染狗肾上皮细胞MDCK，24h后在荧光显微镜下观察。转染空质粒pEGFP-Cl的细胞，绿色荧光分布在整个细胞，而转染pEGFP-Cl-DsGPI和pEGFP-C1-AMF重组质粒的细胞，绿色荧光在整个细胞都有分布，但在细胞核及其周围区域呈聚集现象。　　 结论：　　 1本研究成功克隆了杜氏盐藻GPI基因的ORF序列，构建了原核表达载体pET28a-DsGPI并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了大小约为78kDa的DsGPI融合蛋白。以纯度达到96％的DsGPI蛋白为抗原免疫新西兰自兔制各得到了效价高达1：512000的兔抗DsGPI多克隆抗体，并证明具有较高特异性。　　 2以自制的DsGPI多克隆抗体为一抗，通过Western blots检测了杜氏盐藻在盐胁遣环境下DsGPI的表达变化。在蛋自水平证明了DsGPI是一种盐适应性蛋白，并且完成了自制DsGPI多克隆抗体的首次应用。　　 3通过融合绿色荧光蛋白的真核表达载体的转染，证明转入MDCK细胞的DsGPI-EGFP融合蛋白与人AMF在MDCK细胞中的定位具有明显相似性，为进一步研究DsGPI与人AMF的功能相关性进行了探索。