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萝卜(Raphanus sativus L.)是一种重要十字花科根菜类蔬菜作物,原产于中国,具有较高的食用和药用价值。硝酸盐(NO3-)是作物可以直接利用的重要氮源之一,而硝酸盐是强致癌物亚硝胺的前提,过量摄入会诱发消化器官的癌变,严重威胁人类的健康,尤其对于喜硝态氮的根菜类作物萝卜,是人们摄入硝酸盐的主要来源,目前国内关于萝卜硝酸盐代谢途径中的关键基因分离鉴定研究鲜有报道,极大限制了硝酸盐累积性状的遗传改良。因此通过育种的手段筛选出低硝酸盐含量的萝卜品种,降低萝l、硝酸盐的含量达到人体健康许可的范围,成为萝1、育种的重要目标之一,具有极其重要的实践意义。鉴于此,本文在分析不同萝卜品种硝酸盐累积量差异基础上,分析不同氮素水平对萝卜根冠比、硝酸盐含量及硝酸还原酶活性的影响；分离克隆硝酸盐代谢途径中关键基因及其启动子序列;分析不同氮素处理下硝酸盐同化过程中关键基因的表达特性；并对硝酸盐转运蛋白进行不同品种之间的硝酸盐含量和硝酸还原酶活性的比较,以及不同N03-处理浓度下转运蛋白家族成员的表达特性分析,主要研究结果如下：1.不同氮素水平对萝卜根冠比、硝酸盐含量及硝酸还原酶活性的影响比较分析了15种基因型萝卜材料叶及根的硝酸盐含量的差异,筛选出高硝酸盐含量的品种’NAU-DHP’,中等硝酸盐含量的品种’NAU-QTSH’,低硝酸盐含量的品种’NAU-XHT’。以中等硝酸盐含量的萝卜品种’NAU-QTSH’作为供试材料,采用无土栽培,进行两种处理：不同浓度的N03--N0、5、20、30和50 mmol·L-1处理24 h;不同处理时间0、4、8、12和24 h,NO3--N浓度30 mmol·L-1。分别研究这两种处理对植株根冠比、硝酸盐含量及硝酸还原酶活性的影响,为萝l、生产及施肥提供理论依据。结果表明：根冠比随着处理浓度增加而增加,在30mmol· l-1时达到最大值,然后逐渐降低；而随着处理时间的延长,根冠比也随之增加。叶和根的硝酸盐含量随着处理浓度增加呈现先增加后减少的趋势,而随着处理时间的增加硝酸盐含量也随之增加,但是叶吸收NO3-比根吸收慢,且根的含量比叶高。随着处理浓度增加,叶和根的硝酸还原酶活性均在5mmol·L-1处达到最小值,然后升高至30mmol·L-1随后下降,而随时间延长,叶的硝酸还原酶活性在8 h达到最大,然后迅速下降,而根在4 h达到最大,然后逐渐下降,且叶的活性比根高。2.硝酸盐代谢途径中的关键基因克隆、启动子克隆及载体构建以中等硝酸盐萝卜品种NAU-QTSH’为试验材料,采用同源克隆法,从萝卜叶片中分离得到RsNiR和RsGS2基因组I)NA和cDNA全长以及RsNR、RsGDHl和RsGDH2的c[ )NA全长。其中,RsNiR DNA全长为1936bp,包括1524bp的开放阅读框,编码507个氨基酸;RsGS2 DNA全长为2190bp,包括1287bp的开放阅读框,编码428个氨基酸;RsNR包括2742bp的开放阅读框,编码913个氨基酸；RsGDHl包括1236bp的开放阅读框,编码411个氨基酸;RsGDH2包括1275bp的开放阅读框,编码424个氨基酸。运用染色体步移法克隆了RsNR、RsNiR、RsGS2基因的启动子序列,分别为343bp,843bp,912bp,用PLACE、PlantCARE在线预测工具分析表明：序列含有典型的启动子的特定结构,并含有众多的顺式作用元件和一些其它的调控序列,说明萝l、RsNR、RsNiR、RsGS2基因的表达可能受MYB、光、热响应及其他元件的调控,为进一步研究这些基因的功能和表达特征分析提供理论基础。同时对基因RsNiR、 RsGS2基因进行了表达载体的构建,为萝卜硝酸盐转基因提供了依据。3.硝酸盐同化过程中关键基因表达特性分析以萝卜品种’NAU-QTSH’为实验材料,分别进行NO3--N 0、5、20、30 和 50 mmol·L-1处理24 h和30mmol·L-1 NO3--N处理0、4、8、12和24 h两种处理,研究分析了萝卜不同组织部位中硝酸盐合成代谢途径中的关键基因的表达特性。结果表明：RsNR基因在叶片、根和须根中表达较高,而在叶柄和茎中几乎不表达,且叶和根在30mmol·L-1;农度时达到最大,须根在20 mmol·L-1时达到最大,叶和根在处理4 h时达到最大、叶柄和茎在处理12 h达到最大;RsNiR基因主要在叶和根中表达，在叶柄、茎和须根中表达量较低;RsGS2基因表达在叶中30mmol· L-1处达到最大,根在20mmol·L1处达到最大,且根在处理24 h时达到最大,须根则在处理4 h时达到最大；RsGDH1根在处理浓度为5 mmol·L-1时表达量达到最大,根在处理12 h时达到最大;RsGDH2基因在须根处理50 mmol·L-1时达到最大,根在处理12 h时达到最大；GLN基因家族的基因在根中的表达量最高。本研究基于关键基因的表达特性，揭示了萝l、硝酸盐代谢过程的分子机制,为筛选出低硝酸盐萝卜品种提供依据。4.萝l、硝酸盐转运蛋白家族基因表达特性分析以萝l、(Raphamus sativns L.)高硝酸盐含量品种’NAU-DHP’和低硝酸盐含量品种’NAU-XHT’为供试材料,采用营养液培养方法,测定了0、5 mmol·L-1和50 mmol·L-1 NO3--N处理24 h后硝酸盐含量及硝酸还原酶活性,并应用qRT-PCR方法对NRT1和NRT2基因家族中的关键基因进行了不同组织在不同处理下的表达情况进行了研究。结果表明：不同基因型的萝卜硝酸盐积累量在高浓度下表现的更加明显、DHP的转运硝酸根的能力要比XHT强,且更容易从环境中吸收硝酸根离子。DHP的NRA明显高于XHT,这与培养条件及植株组织部位无关,DHP与XHT相比,对硝酸根吸收能力强,吸收速率快,并且还原利用能力也比XHT强。