论文部分内容阅读
随着全球气候的变化,干旱成为限制植物生长发育的最重要因素之一。与动物不同,植物不能通过移动来逃避干旱胁迫带来的伤害。在干旱环境中,植物为了最大限度的生存下去,通过调整形态结构及生理生化等方面适应逆境环境,并进化出一系列的适应策略。脱落酸(ABA)是植物体内的重要激素之一,参与一系列重要生理过程,并调控植物对环境胁迫的快速响应,特别是干旱胁迫。干旱胁迫下,植物体内ABA的含量迅速增加,促使气孔关闭减少蒸腾失水;并且积累大量代谢物质如脯氨酸、多糖等,以调节植物细胞内渗透势;并调控大量相关基因表达,协同抵抗干旱胁迫对植物组织的伤害。本研究通过对LBD15缺失突变体和过表达植株种子在MS培养基添加ABA和无添加ABA情况下,分析种子萌发和主根伸长生长,以及干旱胁迫下各株系的耐受性,并利用生物化学与分子生物学方法结合生物信息学分析确定LBD15参与ABA信号通路的靶基因ABI4,利用遗传学实验证实其上下游调控关系,最终阐明拟南芥AtLBD15通过参与ABA信号通路调控植物干旱胁迫的分子机理。取得结果如下:1.通过比较缺失突变体和过表达植株种子在MS培养基添加ABA和无添加ABA情况下,分析种子萌发的情况发现,在正常MS培养基上各个种子都正常萌发,而在MS培养基上添加ABA后,LBD15过表达株系种子的萌发明显比野生型敏感,而缺失突变体株系种子对ABA的敏感性明显低于野生型。2.将萌发两天的各株系移栽到含不同浓度ABA的MS培养基上,观察主根伸长生长,在MS培养基上,LBD15过表达植株的主根伸长生长明显比野生型快,而缺失突变体稍微弱于野生型。在MS培养基添加ABA后,各株系都表现出对ABA敏感性,并随着ABA浓度的增高而增强,但是LBD15过表达植株相对于野生型更敏感,而缺失突变体敏感性低于野生型。3.qRT-PCR分析发现ABA相应因子ABI3,ABI4,ABI5和干旱相关基因RAB18和P5CS的表达随着LBD15表达量的变化而发生了明显的变化。将实验用到的6周苗龄的各株系浇透水后,进行干旱实验,经过两周后分析表型发现,大部分植株都已经枯萎,复水3天后我们发现,相对于野生型过表达株系具有更高的存活率,而缺失突变体相对于野生型具有较低的存活率,同时对其进行了失水率和扫描电镜分析,结果显示,过表达植株失水率最低,并且叶片气孔开张度小,从而说明了LBD15通过气孔调控植株失水率参与干旱胁迫。4.利用PlantCARE分析发现LBD15启动子上的ABA响应元件,利用删除PCR法将LBD15启动子上的ABA响应元件删掉,构建ProLBD15:GUS和ProLBD15300-400:GUS表达载体,转化野生型拟南芥,通过对不同转基因株系的ABA处理发现,完整的LBD15启动子受ABA调控,而把LBD15启动子上的ABA响应元件删掉后的转基因植株不受ABA调控,说明LBD15启动子上的ABA响应元件对LBD15响应ABA起着重要的作用。通过与AS2和LBD40功能替换发现,LBD15的Lz区对LBD15的功能具有重要作用,过表达LBD15的植株叶片发生了明显的卷曲,而被AS2和LBD40的Lz区替代后无明显表型,表明AtLBD15功能域Lz区对AtLBD15的功能起着重要的作用。5.通过分析LBD15的启动子(ATG上游1794bp),发现其含有1个ABA蛋白的结合元件,本研究设计了2对引物用以WT、lbd15、OX-LBD15-1、OX-LBD15-2为模板,进行qPCR分析,分析结果发现,ABI4的表达量随着LBD15的升高而升高,暗示ABI4基因表达与LBD15相关。通过EMSA实验分析发现,LBD15蛋白可以直接结合到含有该位点的探针上。利用烟草叶片瞬时表达分析发现,LBD15能够直接激活ABI4表达,并且LBD15的Lz功能域对这一功能具有不可替代的作用。通过遗传学分析也发现LBD15能够增强ABI4的表达。以上结果说明,LBD15能够直接结合到ABI4启动子上激活该基因的表达。6.将lbd15缺失突变体和abi4缺失突变体以及OX-ABI4过表达植株杂交,获得纯合后代F2,分别点播在0、0.1μM ABA和0.2μM ABA的MS培养基上观察表型,在MS培养基上,各株系与野生型相比没有明显的表型,而在添加ABA的培养基上野生型明显的比lbd15、abi4和lbd15xabi4的F2敏感,而且lbd15xabi4的F2代表型与abi4相似。而OX-ABI4过表达株系对ABA敏感,lbd15x OX-ABI4的F2代植株表型与OX-ABI4株系相似。通过以上遗传学结果分析说明AtLBD15是在ABI4的上游起调控作用。