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目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct.)pORF5质粒蛋白能否通过上调宿主细胞NQO1的表达抑制氧化应激反应及IL-6和IL-12的产生,为进一步阐明pORF5质粒蛋白在Ct的致病机制中的作用提供理论依据。方法:pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化的大肠杆菌E.coli XLl-blue接种至含Amp的LB固体平板,扩大培养后经IPTG诱导表达GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白用Glutathione Sepharose 4B纯化及PreScission Protease切除GST标签后得到pORF5质粒蛋白,SDS-PAGE及Western blotting分析并鉴定GST-pORF5融合蛋白和pORF5质粒蛋白。BCA法测定pORF5质粒蛋白浓度,多粘菌素B处理去除内毒素。以不同浓度(0、5、10、15 μg/mL)pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24 h及最佳浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞不同时间(0、6、12、18、24 h)后,RT-qPCR 检测 HeLa 细胞 NQO1的mRNA转录水平,Western blotting检测HeLa细胞NQO1的蛋白表达情况;收集不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18 h的细胞或培养液上清,LPS刺激为阳性对照组,分别检测丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)及总抗氧化能力(T-AOC);10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激感染Ct的HeLa细胞不同时间,并以相同时间点PBS处理感染衣原体的HeLa细胞作为对照,分别检测MDA、T-SOD及T-AOC,间接免疫荧光法检测包涵体形成;不同浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA处理的THP-1细胞24 h及最佳浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA处理的THP-1细胞不同时间,收集细胞培养液上清,ELISA分别检测IL-6和IL-12的水平。10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激经siRNA-NQO1干扰NQO1表达的HeLa细胞及未干扰的对照细胞18 h后,分别检测MDA、T-SOD及T-AOC;15μg/mL pORF5质粒蛋白刺激经siRNA-NQO1干扰NQO1表达的THP-1细胞及未干扰的对照细胞18 h后,ELISA分别检测IL-6和IL-12的水平。结果:1.pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化菌经诱导表达分子量约为54 kDa的GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经纯化及切除GST标签后得到分子量约为28 kDa的pORF5质粒蛋白。2.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24h后,RT-qPCR及Western blotting结果显示HeLa细胞中NQO1的mRNA水平及蛋白水平呈浓度依赖性上升,且在10 μg/mL时上调最明显;以10μg/mL浓度的pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞不同时间后Western blotting结果显示当刺激时间为18h,HeLa细胞中NQO1的蛋白水平上调最明显。3.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18 h后,MDA、T-SOD及T-AOC检测结果显示:与LPS 阳性对照组相比,当pORF5质粒蛋白刺激浓度为10 μg/mL时,MDA含量最少,为0.21±0.02 nmol/mg(P<0.01),T-SOD 及 T-AOC 含量最高,分别为 48.79±1.83 U/mL(P<0.01)和 50.76±0.94U/mL(P<0.01)。4.10 μg/mL pORF5质粒蛋白刺激感染Ct的HeLa细胞不同时间后,相比于PBS对照组,MDA检测结果显示在18h时,MDA的减少程度最明显,为1.35±0.04 nmo1/mg(P<0.01):T-SOD和T-AOC检测结果均显示在18h时,二者的升高程度最明显,分别为26.61士2.21 U/mL(P<0.01)和 34.40±2.50U/mL(P<0.01)。间接免疫荧光结果显示:对照组IFU为7.13 × 105/mL,pORF5刺激组IFU为9.03 X 105/mL,包涵体数量较对照组多26.7%(P<0.05)。5.不同浓度pORF5质粒蛋白刺激经PMA预处理的THP-1细胞24 h后,ELISA结果显示IL-6及IL-12的水平呈浓度依赖性减少且在浓度为15μg/mL时,IL-6及IL-12的水平分别为3.83±0.37 pg/mL(P<0.01)和 2.24±0.01pg/mL(P<0.01);15 μg/mL pORF5 质粒蛋白刺激经PMA预处理后的THP-1细胞不同时间后,ELISA结果显示IL-6及IL-12的水平呈时间依赖性减少且在刺激时间为18 h时,IL-6及 IL-12 的水平分别为 2.07±0.55 pg/mL(P<0.05)和 2.31±0.14 pg/mL(P<0.01)。6.pORF5质粒蛋白刺激干扰NQO1蛋白表达的HeLa细胞后,MDA、T-SOD和T-AOC检测结果显示:与未干扰的对照组相比,MDA 含量增加 0.92±0.27 pg/mL(P<0.05),T-SOD 和 T-AOC 含量分别降低 21.90±3.36U/mL(P<0.05)和 22.51±2.82U/mL(P<0.01)。pORF5质粒蛋白刺激干扰NQO1蛋白表达的THP-1细胞后,ELISA结果显示:与未干扰的对照组相比,IL-6及IL-12的水平分别升高11.16±3.13pg/mL(P<0.05)和6.91±0.32pg/mL(P<0.01)。结论:沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过上调宿主细胞NQO1蛋白的表达发挥抗氧化应激作用并抑制IL-6及IL-12的产生。