前言 巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是导致垂直传播最常见的病原体,新生儿CMV感染可累及多个器官,从而表现出症状的多样性。目前CMV感染新生儿的致病性研究多集中在母婴传播途径和临床治疗等方面,而对不同基因型CMV的致病性差异方面的研究较少。本实验以111例CMV感染患儿尿中CMV为模板,应用巢式PCR扩增CMV gB基因片段后,应用限制性内切酶Rsa Ⅰ和Hinf Ⅰ,酶切分型。对引起新生儿感染CMV gB基因型进行分析,研究不同gB基因型CMV致病性的差异。 方法 1.扩增模板制备:具有临床资料的111例CMV感染新生儿尿样本中提取CMV DNA。 2.目的基因片段扩增:采用巢式PCR扩增CMV gB基因片段。外侧引物应用文献所应用的引物。5’引物1:5’-GTTCCGAAGC-CGAAGACTCG;5’引物2:5’-GCAGCACCTGGCTCTATCG;5’引物3:5’-GCCAGCTCACCTTCTGG,3’引物:3’-GCACCTTGACGCTGGTTTGG。内侧引物引自文献:5’-TGGAACTCGAACGTTTGGC 3’-GAAACGCGCG-GCAATCG。(引物由上海博亚生物技术有限公司合成)。PCR扩增体系为50μl。反应程序如下:95℃预变性4min后开始循环,95℃变性1min,55℃退火4.5sec,72℃延伸45sec,共35个循环,最终72℃延伸5min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 3.限制性内切酶酶切:将扩增的CMV gB基因片段分别用限制性内切酶Rsa Ⅰ(购自promega公司)和Hinf Ⅰ(购自大连宝生物)酶切,3%琼脂糖凝胶电泳鉴定分型。 4.统计学分析:分析引起新生儿感染的CMV gB基因型,以及新生儿感