近年来,肺癌的发病率和病死率均呈明显上升趋势,是癌症相关性死亡的首要原因。大约80%的肺癌患者病理类型为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC),其中超过70%肺癌确诊时为局部晚期或晚期。虽然NSCLC的手术、放疗、化疗及靶向治疗方面已取得了较大进展,但目前NSCLC患者的5年生存率仍低于15%。放射治疗为局部晚期NSCLC的重要治疗手段,超过609%的NSCLC患者在患病期间需要行放射治疗。低氧现象在实体瘤中普遍存在,是影响肿瘤放射敏感性的重要因素之一。当肿瘤增长至数毫米时即可发生低氧,故低氧也是实体肿瘤微环境的基本特征之一。另外,低氧还可以激活肿瘤细胞内一系列基因的应答反应,改变很多基因的转录活性,导致癌细胞一系列生物学行为的改变。低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)作为一种转录因子在低氧环境中起着中枢纽带作用,也是近年来肿瘤治疗研究的热点。HIF-1是一种异源异二聚体,由HIF-1α亚基和HIF-1α亚基构成。HIF-1α在正常氧分压下由细胞持续合成后即被迅速降解,而在低氧条件下,细胞合成增多同时蛋白降解途径被阻断导致大量的HIF-1α蛋白在细胞核内快速集聚并与HIF-1β结合后形成有活性的HIF-1,对多种基因的转录起到参与和调控作用,在肿瘤能量代谢、新生血管形成及侵袭转移等多个方面发挥重要作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是把与目的基因同源的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转染至靶细胞内,与靶细胞内的内切酶结合并形成诱导沉默复合体(RNAi inducing silence complex, RISC)。以si RNA为模板,RISC能够特异性地识别出其同源基因mRNA并对其进行递进式地剪切,诱导具有特异性序列的mRNA降解,且少量的siRNA就可以有效地抑制目的基因的表达。人工设计的短发卡状RNA (short hairpin RNA, shRNA)与mi RNA类似,也能诱导RNAi。HIF-1α特异性小分子拮抗剂PX-478能够抑制多个细胞系癌细胞,降低HIF-1表达并能启动下游信号转导。本研究首先通过观察体外氯化钴溶液诱导低氧对肺癌A549细胞体外生物学行为和放射敏感性的影响,应用HIF-1α小分子拮抗剂PX-478进行干预,探讨低氧对A549细胞生物学行为及放射敏感性影响的相关机制；其次,采用RNAi技术建立稳定转染人肺腺癌细胞系A549细胞,通过检测RNAi沉默HIF-1α及HIF-1α特异性拮抗剂PX-478对A549细胞体外放射敏感性影响并进一步探讨其具体的分子作用机制；最后,通过建立裸鼠移植瘤模型,探讨RNAi沉默HIF-1α及PX-478对A549细胞体内放射敏感性的影响。本研究为两种不同的干预方法的头对头对比研究,因干预效果在相同的条件下进行其可比性好,预期研究结果可为肺癌增敏放疗提供实验室依据。第一部分低氧对肺癌A549细胞体外生物学行为的影响目的：探讨低氧对肺癌A549细胞体外生物学行为的影响及其作用机制。方法：采用氯化钴溶液化学低氧法模拟肿瘤低氧微环境,MTT法检测不同浓度及不同作用时间氯化钴溶液对A549细胞体外增殖的影响,流式细胞术检测低氧对A549细胞细胞周期和凋亡影响,荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应检测不同低氧时相时A549细胞中HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2mRNA的表达。免疫印迹(Western blot)检测HIF-1α特异性拮抗剂PX-478联合低氧处理A549细胞后,HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2蛋白的表达变化。细胞划痕试验和Transwell实验检测PX-478联合低氧对A549细胞迁移及侵袭能力的影响。结果：浓度低于150μmol/L的氯化钻溶液,对细胞的增殖无明显抑制作用,当浓度达到200μmol/L时,氯化钻溶液对A549细胞的增殖抑制作用明显,且随着氯化钴溶液作用时间的延长,抑制作用逐渐增强,流式细胞术检测发现氯化钻溶液诱导低氧可引起A549细胞G0/G1期细胞阻滞,S期细胞减少,与各组相比,缺氧24小时组S期细胞最少(P<0.05)；而对G2/M期、凋亡影响不大(P>0.05)。经RealTime PCR检测,HIF-1α mRNA随低氧时间的延长其无变化(P>0.05),E-钙黏蛋白mRNA随低氧时间的延长,其表达水平逐渐降低,而MMP-2随低氧时间延长,其mRNA表达逐渐升高,低氧不同时间组间mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。低氧可诱导细胞表达HIF-1α蛋白,A549细胞经PX-478处理后,HIF-1α蛋白表达再次被显著抑制。E-钙黏蛋白在低氧条件下的表达明显低于常氧组,但经PX-478作用后,其表达再次升高。MMP-2在低氧条件下表达显著强于常氧组,PX-478可抑制MMP-2的升高,此3种蛋白在常氧条件下均不受PX-478影响。细胞划痕试验检测结果提示：低氧较常氧组A549细胞迁移能力增强,PX-478能够减弱低氧A549细胞迁移能力,但对常氧A549细胞迁移能力无影响。Transwell侵袭实验结果提示：低氧较常氧组A549细胞侵袭能力增强,PX-478能够减弱低氧A549细胞侵袭能力,但对常氧A549细胞侵袭能力无影响。结论：低氧可抑制A549细胞增殖,产生GO/G1期细胞阻滞,S期细胞减少,低氧使A549细胞迁移和侵袭能力增强,HIF-1α特异性拮抗剂PX-478可降低该作用,其机制可能是PX-478抑制低氧引起的HIF-1α蛋白表达增加,同时逆转低氧条件下E-钙黏蛋白的降低和MMP-2蛋白表达的升高。低氧引起A549细胞出现G0/G1期阻滞可能与肺癌A549细胞对射线的敏感性降低有关。第二部分HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体的制备和稳定转染肺癌A549细胞的建立目的：构建HIF-1α RNA干扰慢病毒载体,筛选HIF-1α基因稳定沉默的A549细胞株。方法：设计4对HIF-1α基因的反义寡核苷酸片段和一对无义序列,经过退火及酶切后,克隆入RNA干扰表达载体pGV118,体外扩增纯化后,得到重组构建的pGV118-HIF-1α-shRNA干扰表达载体；通过脂质体LipofectamineTM2000介导将pGV118-HIF-1α-shRNA干扰表达载体转染肺癌A549细胞；采用RealTime PCR、 Western blot方法检测转染pGV118-HIF-1α-shRNA的A549细胞中HIF-1α表达水平的变化。结果：RT-PCR鉴定结果表明成功构建了4个shRNA表达载体,并筛选出抑制效果最佳的shRNA表达载体pGV118-HIF-1α-shRNA3, RealTimePCR检测提示携带pGV118-HIF-1α-shRNA3的慢病毒感染A549细胞后HIF-1α mRNA水平明显下降,而携带空载体的慢病毒感染A549细胞对HIF-1α mRNA表达无明显影响,Western blot检测提示携带pGV118-HIF-1α-shRNA3的慢病毒感染A549细胞后HIF-1α蛋白水平明显下降,而携带空载体的慢病毒感染A549细胞对HIF-1α mRNA表达无明显影响。结论：成功建立质粒连接的HIF-1a shRNA,并筛选出比较理想的HIF-1a shRNA转染质粒。采用慢病毒包装系统包装质粒,生产高滴度的病毒液,感染肺癌A549细胞株后,HIF-1α在mRNA及其蛋白水平均明显下降,成功构建了人基因HIF-1α蛋白低表达的肺癌A549细胞株。第三部分RNA干扰HIF-1α及PX-478对肺癌A549细胞体外放射敏感性的影响目的：观察RNA干扰HIF-1α及PX-478对肺癌A549细胞体外放射敏感性的影响。方法：将实验细胞分为空白对照组、阴性对照组、siRNA实验组及PX-478实验组,分别在常氧和低氧条件下检测各组细胞细胞周期分布情况,低氧条件下检测各组细胞凋亡情况,免疫荧光技术检测各组细胞行4Gy X线照射4小时及24小时后γ-H2AX焦点情况,荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应检测各组细胞低氧条件下VEGF mRNA水平,免疫印迹技术检测各组细胞低氧条件下VEGF蛋白表达情况,各组细胞分别行OGy、2Gy、4Gy、6Gy及8Gy的X线照射,平板克隆形成实验检测各组细胞存活分数。结果：常氧条件下各组细胞细胞周期分布无统计学差异(P>0.05),低氧条件下siRNA实验组及PX-478实验组G0/G1期细胞比例较两对照组明显降低(P<0.001),低氧条件下siRNA实验组及PX-478实验组细胞凋亡率较两对照组明显降低(P<0.001),免疫荧光技术检测提示siRNA实验组及PX-478实验组γ-H2AX焦点数目较两对照组明显增多(P<0.001),RealTimePCR检测提示低氧条件下siRNA实验组及PX-478实验组VEGF mRNA水平较两对照组明显下降(P<0.001),Western blot检测提示低氧条件下siRNA实验组及PX-478实验组VEGF蛋白表达水平较两对照组明显下降(P<0.001),平板克隆形成实验提示在各照射剂量点siRNA实验组及PX-478实验组细胞存活分数均较两对照组降低(P<0.005),两实验组及两对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：RNA干扰HIF-1α及PX-478均能够通过改变细胞周期分布、增加细胞凋亡、增加放射后DNA双链断裂及抑制VEGF表达等机制提高A549细胞放射敏感性。第四部分RNA干扰HIF-1α及PX-478对肺癌A549细胞体内放射敏感性的影响目的：观察RNA干扰HIF-1α及PX-478对肺癌A549细胞体内放射敏感性的影响。方法：使用A549细胞、pGV118-HIF-1α-shRNA3’慢病毒稳定转染的A549细及携带空载体的慢病毒感染A549细胞建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将荷瘤裸鼠分为空白对照组、阴性对照组、siRNA实验组及PX-478实验组,分组后进行不同剂量的放射线照射,建立生长曲线,对比研究两组肿瘤照射后的放疗反应,根据生长延缓和照射剂量分析其放射敏感性差异；对两种肿瘤标本进行HE及免疫组化染色,比较其HIF-1α及Ki67表达差异。结果：siRNA实验组及PX-478实验组裸鼠皮下移植瘤生长明显慢于空白对照组和阴性对照组,免疫组化染色显示, siRNA实验组及PX-478实验组肿瘤中HIF-1α及Ki67的表达均明显低于空白对照组和阴性对照组。X线照射可以使各组移植瘤均出现生长缓慢甚至体积减小,siRNA实验组及PX-478实验组射线照射后生长延缓更加明显,计算结果SER大于1。结论：RNA干扰HIF-1α及PX-478有放射增敏作用,在体内能提高A549细胞的放疗敏感性,机制可能与其延缓增殖有关。