【摘 要】
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第一部分:体外制备HBV cccDNA的策略研究目的:探索一种便捷、快速的体外合成HBV cccDNA的方法,在细胞层面验证其功能性,为研究临床HBV耐药基因型的cccDNA功能提供有力的工具。方法:根据HBV rcDNA的特殊结构,设计分别以负链为模板和以正链为模板的PCR引物,对HBV基因组进行两段PCR扩增,两段PCR产物作为HBV DNA体外环化构建cccDNA的原料。以Gibson As
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第一部分:体外制备HBV cccDNA的策略研究目的:探索一种便捷、快速的体外合成HBV cccDNA的方法,在细胞层面验证其功能性,为研究临床HBV耐药基因型的cccDNA功能提供有力的工具。方法:根据HBV rcDNA的特殊结构,设计分别以负链为模板和以正链为模板的PCR引物,对HBV基因组进行两段PCR扩增,两段PCR产物作为HBV DNA体外环化构建cccDNA的原料。以Gibson Assembly无缝克隆技术为基础,对该方法的预混液配方作出一定改良后,尝试用于体外制备HBV cccDNA。通过该方法构建的HBV cccDNA产物经酚氯仿抽提纯化后,转染肝癌细胞系（Huh7,Hep G2）,经过5-7天培养后分离细胞和培养基。提取细胞中的HBV复制中间体,通过实时荧光定量PCR测定病毒复制的拷贝数;通过ELISA方法对培养基上清中的HBV分子标志物HBeAg、HBsAg进行测定。将该方法应用于临床耐药样本,制备耐药基因型的环状DNA,用于后续功能分析研究。结果:成功建立一种在体外直接构建环状的HBV cccDNA的方法,两个截短的HBV DNA片段通过改良Gibson无缝克隆组装的方法在体外成功合成完整的HBV cccDNA。体外合成的cccDNA转染细胞后具备HBV的生物学功能,细胞分泌表达HBeAg、HBsAg等相应的HBV分子标志物,与已报道的一步法扩增HBV全长DNA后经酶切、自连接环化再转染的方法相比更加迅速、便捷;改良后的自制Gibson反应液与商品化试剂相比成本更为低廉。结论:成功建立体外合成HBV cccDNA的方法,有希望应用于临床大批量耐药样本的基因型分析。第二部分SARS-CoV-2病毒相关蛋白的体外表达及功能鉴定目的:构建包含SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区基因的原核表达质粒,转化入大肠杆菌并进行诱导培养,获得功能性的重组RBD蛋白;构建包含SARS-CoV-2衣壳蛋白N基因的pPIC9K重组质粒,转化入毕赤酵母并进行诱导培养,获得功能性的重组N蛋白方法:（1）RBD蛋白的表达与纯化:分析SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区域的DNA序列,通过生物信息软件对该序列中的稀有密码子进行替换优化,优化后的RBD DNA全序列在体外人工合成,并插入到pGEX6P-1及pET28a原核表达载体中,构建出RBD重组质粒。将RBD重组质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞后进行菌液PCR鉴定阳性重组菌,选择阳性克隆菌株放大培养并添加IPTG进行外源蛋白的诱导表达,亲和层析法纯化RBD蛋白,使用SDS-PAGE、Westen Blot、Pulldown、ITC、ELISA等方法检测蛋白表达并验证其生物活性。（2）核衣壳（Nucleocapsid）蛋白的表达与纯化:分析SARS-CoV-2核衣壳蛋白的DNA序列并在体外人工合成到pPIC9K真核表达载体中,获得pPIC9K/N重组质粒。将pPIC9K/N重组质粒转化毕赤酵母GS115感受态细胞后进行菌液PCR鉴定阳性重组菌,选择阳性克隆扩大培养,用甲醇诱导表达外源蛋白,亲和层析纯化重组N蛋白,使用SDSPAGE、Western Blot检测蛋白表达。结果:pGEX6P-1/RBD表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,经鉴定为可溶性的重组GST-RBD蛋白。GST-RBD蛋白在体外能够与人ACE2蛋白结合,并具较强的亲和力;HIS-RBD蛋白在pET28a/RBD表达菌中多以包涵体形式存在,经纯化复性后,产量更高,且经ITC鉴定,能与ACE2发生特异性结合,亲和力高达129 nmol/L;N蛋白在GS115中成功实现分泌表达,在培养基上清中检测到大量N蛋白。结论:通过在大肠杆菌中诱导表达的方法,成功获得有功能的重组RBD蛋白,该重组蛋白具体与人ACE2受体结合的功能,可用于新冠病毒抗病毒药物研究和疫苗开发等多方面工作。
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